桃果實(shí)PpCuZnSOD基因的原核表達(dá)、純化與鑒定

吳軍帥 叢麗君等

摘 要： 【目的】為了實(shí)現(xiàn)桃銅鋅超氧化物歧化酶在大腸桿菌中的高效表達(dá)，獲得表達(dá)穩(wěn)定、蛋白純度高、活性強(qiáng)的工程菌，【方法】將前期獲得的PpCuZnSOD基因（GenBank登錄號(hào)：JX217743）重組到原核表達(dá)載體pET-32a（+）中，并轉(zhuǎn)化到Escherichia coli BL21（DE3）宿主菌，經(jīng)IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting 檢測(cè)，鎳柱親和層析純化，并采用Brad Ford 方法測(cè)定融合蛋白濃度，黃嘌呤氧化法分析其酶活。【結(jié)果】成功的構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-32a（+）-PpCuZnSOD，并獲得分子質(zhì)量約為35 kDa的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物，純化后融合蛋白濃度為183.7 mg·L-1，活性為5.23×103 U·mg-1。 【結(jié)論】成功構(gòu)建了桃pET-32a（+）-PpCuZnSOD原核表達(dá)載體，表達(dá)量高、穩(wěn)定性強(qiáng)，重組表達(dá)產(chǎn)物具有較高CuZnSOD酶活性，為桃CuZnSOD酶的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 桃； PpCuZnSOD； 原核表達(dá)； 純化； 鑒定

中圖分類號(hào)：S662.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪02-0185-06

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）在植物中普遍存在， 具有清除自由基、維持活性氧代謝平衡、保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的功能、延緩器官衰老過程的作用[1]。根據(jù)酶活性中心的輔基部位結(jié)合的金屬離子的不同，SOD可分為3 種類型：CuZnSOD、MnSOD和FeSOD[2]，其中CuZnSOD是3種歧化酶中含量最豐富的一種，是活性氧清除酶系統(tǒng)中最重要的酶，具有減輕膜脂過氧化的作用。大量研究發(fā)現(xiàn)，提高植物體內(nèi)抗氧化酶活性和增強(qiáng)抗氧化代謝的水平是提高植物抗逆性的有效途徑[3-6]。SOD的研究受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[7]。前人對(duì)草莓[8]、番荔枝[9]、桃[10]等果實(shí)成熟軟化的研究表明，SOD酶活性與果實(shí)硬度密切相關(guān)；此外SOD在醫(yī)療保健方面和食品加工等方面也具有重要作用，CuZnSOD 是一種療效廣泛的藥用酶，在適當(dāng)?shù)臈l件下，補(bǔ)充外源SOD能調(diào)節(jié)機(jī)體的代謝、提高人體的免疫功能，能夠有效的防治某些疾病和延緩衰老，SOD作為保鮮劑、抗氧化劑以及功能食品的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑在食品加工方面也有著廣闊的應(yīng)用前景[11-12]。

近年來， 對(duì)幾種主要模式生物SOD基因的克隆、功能分析以及蛋白質(zhì)表達(dá)已進(jìn)行了深入的研究[13]，在陸地棉[14]、野桑蠶[15]、楊梅[16]和珍珠粟[17]等植物中發(fā)現(xiàn)的CuZnSOD也實(shí)現(xiàn)了體外表達(dá)。筆者在桃中獲得了包含完整編碼區(qū)的PpCuZnSOD基因（GenBank登錄號(hào)：JX217743），在此基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)載體pET-32a（+）-PpCuZnSOD， 并在大腸桿菌中得到高效表達(dá)，層析純化后獲得具有高活性的CuZnSOD酶，對(duì)進(jìn)一步研究PpCuZnSOD基因的作用功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

大腸桿菌 DH5α用于基因克隆，BL21（DE3）作為融合蛋白表達(dá)的宿主，2種大腸桿菌均為實(shí)驗(yàn)室保存。pGEM-PpCuZnSOD 重組質(zhì)粒，PCR產(chǎn)物克隆的載體pGEM-T vector和DNA回收試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司，PCR Kit購(gòu)自Ferments公司，TaKaRa公司的MiniBEST Plasmid KIT Purification質(zhì)粒提取試劑盒，表達(dá)載體 pET-32a（+）購(gòu)自Novagen，限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I以及 T4 DNAligase均購(gòu)自Fermentas；SOD 試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，Ni-NTA SefinoseTM Kit，DAB顯色試劑盒購(gòu)自生工生物；一抗、二抗購(gòu)自北京博奧森公司。

1.2 方法

1.2.1 融合蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建 1）PpCuZnSOD基因CDS引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增。以克隆得到的PpCuZnSOD基因序列為模板設(shè)計(jì)桃PpCuZnSOD基因CDS的PCR引物，設(shè)計(jì)如下包含BamH I和Xho I識(shí)別位點(diǎn)的引物。PpCuZnSOD-F：5'-CGCGGATCCATGGTGAAGGGCGTTGCTGTT-3'，CGCGGATCC為接頭序列，其中CGCG為保護(hù)堿基，GGATCC為BamH I識(shí)別位點(diǎn)，并包含了PpCuZnSOD的CDS的起始密碼子ATG；PpCuZnSOD-R：5'-CCGCTCGAGTCAGTTTTGGAGACCAATAAT-3'。CCGCTCGAG為接頭序列，其中 CCGC為保護(hù)堿基，CTCGAG為Xho I的識(shí)別位點(diǎn)，TCA為終止密碼子TGA的反向互補(bǔ)序列。以PpCuZnSOD基因連接克隆到pGEM-T vector的菌液為模板，進(jìn)行CDS的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系：上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，cDNA模板1 μL，2xPCR Master Mix用12.5 μL，終體積25 μL；擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min， 94 ℃ 45 s， 62 ℃ 45 s， 72 ℃ 45 s， 共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收連接后轉(zhuǎn)至DH5α，挑取單菌落振蕩培養(yǎng)菌落PCR檢測(cè)后，隨機(jī)挑選5個(gè)條帶大小與預(yù)期相符的單菌落送公司測(cè)序。

2）質(zhì)粒提取、雙酶切、連接轉(zhuǎn)化及檢測(cè)。提取pGEM- PpCuZnSOD重組質(zhì)粒及pET-32a（+）質(zhì)粒，分別對(duì)pGEM-PpCuZnSOD重組質(zhì)粒及pET-32a（+）進(jìn)行雙酶切反應(yīng)：H2O19 μL，10×K buffer O 4.0 μL，質(zhì)粒（重組質(zhì)粒及載體）DNA15.0 μL（約10 μg），BamH I和Xho I各1 μL，37 ℃酶切3 h。

目的基因酶切產(chǎn)物與表達(dá)載體進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并回收，然后進(jìn)行連接，連接體系為：H2O 27 μL，ligation buffer 1.0 μL，目的基因10.0 μL，表達(dá)載體1.0 μL，T4 DNAligase1.0 μL，16 ℃過夜連接。次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH5α涂板培養(yǎng)，獲得陽(yáng)性克隆后繼續(xù)培養(yǎng)提取質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)至感受態(tài)BL21（DE3），涂板培養(yǎng)所得到的陽(yáng)性克隆即為pET-32a（+）-PpCuZnSOD重組質(zhì)粒。最后進(jìn)行重組質(zhì)粒的雙酶切檢測(cè)。

1.2.2 pET-32a（+）-PpCuZnSOD重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 1）樣品的處理。分別從轉(zhuǎn)化組和對(duì)照組的培養(yǎng)液中取1 mL菌液，4 000 r·min-1離心5 min，收集沉淀，加100 μL 1% SDS凝膠加樣緩沖液（1.0 mol·L-1 Tris-HCl（pH 6.8），10%甘油，10%SDS，DTT，0.1%溴酚藍(lán)），劇烈振蕩懸浮，混勻后，沸水浴10 min。迅速冷卻至室溫，4 ℃放置，用于SDS-PAGE分析。

2）最佳IPTG誘導(dǎo)濃度的篩選。挑取攜帶有pET-32a（+）-PpCuZnSOD表達(dá)載體的BL21（DE3）單菌落培養(yǎng)于3 mL LB培養(yǎng)基（含氨芐青霉素25 mg·L-1）中，37 ℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)過夜。用含pET-32a（+）質(zhì)粒的BL21（DE3）菌株作為對(duì)照。按1%（v/v）接種量轉(zhuǎn)接于20 mL LB培養(yǎng)基中（含氨芐青霉素25 mg·L-1），振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)0.7左右，加IPTG至終濃度分別為0 mmol·L-1、0.1 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、1.0 mmol·L-1，37 ℃，200 r·min-1震蕩培養(yǎng)4 h。

3）最佳誘導(dǎo)時(shí)間的篩選。加0.5 mmol·L-1 IPTG后分別誘導(dǎo)0 h、2 h、4 h和6 h，用含pET-32a（+）質(zhì)粒的BL21（DE3）菌株作為對(duì)照。

4）重組蛋白SDS-PAGE分析。表達(dá)蛋白的電泳分離蛋白質(zhì)分離采用垂直板電泳系統(tǒng)，分離膠12%，濃縮膠5%，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V。電泳結(jié)束后經(jīng)考馬斯亮蘭染色，再脫色，最后拍照。

5）重組蛋白的純化、濃度測(cè)定及活性鑒定。按Ni-NTA SefinoseTM Kit的說明進(jìn)行融合蛋白的純化操作；采用Brad ford 方法測(cè)定融合蛋白質(zhì)濃度，以牛血清白蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)；按南京建成生物工程研究所CuZnSOD試劑盒測(cè)定表達(dá)蛋白的活性。

6）重組蛋白的Western blotting 檢測(cè)。將已表達(dá)的重組蛋白pET-32a（+）-PpCuZnSOD樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，分別用TBST和TBS洗滌，用封閉液封閉2 h，孵育一抗（在搖床上緩慢搖動(dòng)2 h， 再用TBST和TBS洗滌）及二抗（在搖床上緩慢搖動(dòng)2 h，再用洗滌液洗3 次），最后使用DAB顯色試劑盒顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 PpCuZnSOD基因CDS的擴(kuò)增、目的產(chǎn)物與pGEM-T載體的連接

以pGEM-PpCuZnSOD 重組質(zhì)粒的菌液為模板進(jìn)行CDS的PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳如圖1所示，有且僅有一條亮度很高且大小接近500 bp的條帶，與理論值459 bp相符。將目的條帶回收并進(jìn)行pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化涂板后同樣進(jìn)行PCR檢測(cè)和測(cè)序證明CDS序列正確。

2.2 pET-32a（+）-PpCuZnSOD原核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)分析

將PpCuZnSOD基因CDS與pGEM-T載體連接成功的載體進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收CDS片段， pET-32a（+）質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切，連接、轉(zhuǎn)化DH5α、涂板、培養(yǎng)后選取陽(yáng)性克隆繼續(xù)培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，最后再轉(zhuǎn)入BL21（DE3），獲得陽(yáng)性克隆即為pET-32a（+）-PpCuZnSOD重組載體，做菌液PCR檢測(cè)結(jié)果與圖1基本一致，提取重組質(zhì)粒做雙酶切檢測(cè)，如圖2所示，能夠清楚地看出雙酶切產(chǎn)物與圖1的產(chǎn)物大小基本一致，約500 bp。泳道1為對(duì)照pET-32a（+）-PpCuZnSOD重組質(zhì)粒，有2條帶，上者為部分解鏈的環(huán)狀雙鏈態(tài)，下者為超螺旋態(tài)，雙酶切殘留的線性態(tài)pET-32a（+）質(zhì)粒正好位于2者之間，約大于 5 000 bp，與理論值相符。PCR鑒定與雙酶切鑒定的結(jié)果表明載體已構(gòu)建成功，可用于后續(xù)的PpCuZnSOD原核表達(dá)研究。

獲得pET-32a（+）-PpCuZnSOD重組載體后，進(jìn)行相應(yīng)的IPTG誘導(dǎo)，首先是不同濃度IPTG（0～1 mmol·L-1）誘導(dǎo)4 h，以篩選最佳誘導(dǎo)濃度，然后以最佳誘導(dǎo)濃度0.5 mmol·L-1誘導(dǎo)不同的時(shí)間（0～6 h），進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖3所示，蛋白表達(dá)明顯，IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)空表達(dá)載體pET-32a（+）的大腸桿菌在 20 kDa附近有自身誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)，IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pET-32a（+）-PpCuZnSOD的大腸桿菌在35 kDa處出現(xiàn)了特異的融合蛋白（圖中已標(biāo)注），此外不同濃度的IPTG對(duì)該表達(dá)載體的表達(dá)影響不顯著，相同濃度IPTG誘導(dǎo)下蛋白的表達(dá)量會(huì)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢增加，但上升趨勢(shì)也不是很明顯。結(jié)果說明pET-32a（+）-PpCuZnSOD重組載體在大腸桿菌中成功表達(dá)，并且容易誘導(dǎo)，只需要0.1 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)2 h即可。

參照生工生物公司的Ni-NTA SefinoseTM Kit說明書對(duì)所表達(dá)蛋白進(jìn)行純化，得到較純的融合蛋白條帶采用Brad ford 方法測(cè)定融合蛋白質(zhì)濃度，以牛血清白蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)置不同梯度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線3次測(cè)定吸光值，計(jì)算所得純化蛋白的濃度約為183.7 mg·L-1。

分別取未純化蛋白和純化蛋白10 μL（加上樣緩沖液10 μL，共20 μL），進(jìn)行Western blotting 分析進(jìn)一步驗(yàn)證了pET-32a（+）-PpCuZnSOD在大腸桿菌中得到了正確的表達(dá)。利用南京建成生物工程研究所的CuZnSOD試劑盒測(cè)得純化蛋白的活性約為5.23×103 U·mg-1，這說明該基因在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。

3 討 論

大量研究表明，果實(shí)成熟衰老與活性氧代謝有關(guān)，在果實(shí)后熟衰老時(shí)明顯增加，可能是調(diào)節(jié)果實(shí)成熟衰老的一種重要的自由基[18-19]，而SOD恰恰可以清除這種自由基；在植物中過量表達(dá)CuZnSOD 能提高植物的抗逆性[20]。而如何實(shí)現(xiàn)SOD相關(guān)基因的體外表達(dá)，甚至實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)是很多人關(guān)注的問題，所以長(zhǎng)久以來，前人們做了很多這方面的工作并且取得了一定的成績(jī)。在西紅柿[21]、楊梅[22]和海灣扇貝[23]中都獲得CuZnSOD的體外表達(dá)蛋白，并且體外活性分別達(dá)到3×105 U·L-1和1.013×106 U·L-1培養(yǎng)基以及1015.36 U·mg-1；在以模式植物為代表的煙草[24]和擬南芥[25]等植物中都獲得MnSOD的體外表達(dá)，此外還有部分植物FeSOD的體外表達(dá)[26]。

桃本身作為呼吸躍變型果實(shí)，呼吸高峰之后果實(shí)質(zhì)地發(fā)生明顯改變，果肉腐爛，針對(duì)這種現(xiàn)象，筆者利用表達(dá)載體pET-32a（+）成功表達(dá)了PpCuZnSOD基因的融合蛋白，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)融合蛋白的分離純化和活性鑒定，這為系統(tǒng)研究 PpCuZnSOD基因的作用功能、系統(tǒng)進(jìn)化積累了一定的經(jīng)驗(yàn)， 也為后續(xù)利用該基因進(jìn)行植物遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn) References：

[1] BOWLER C， VAN C W， VAN M M. Superoxide dismutase in plants [J]. Critical Reviews in Plant Science， 1994， 13： 199-218.

[2] ZHENG Rong-liang. Free radical biology[M]. Beijing： Higher Education Press， 1992： 1-2.

鄭榮梁. 生物學(xué)自由基[M]. 北京： 高等教育出版社， 1992： 1-2.

[3] MCKERSIE B D， CHEN Y R， BEUS M D E， BOWLEY S R， BOWLER C， INZE D， D'HALLUIN K， BOTTERMAN. Superoxide dismutase enhances tolerance of freezing stress in transgenic alfalfa （Medicagosativa L.）[J]. Plant Physiology，1993，103（4）： 1155-1163.

[4] MITTLER R， ZILINSKAS B A. Regulation of pea cytosolic ascorbate peroxidase and other antioxidant enzymes during the progression of drought stress and following recovery from drought[J]. The Plant Journal， 1994， 5（3）： 397-405.

[5] TANAKA Y， HIBINO T， HAYASHI Y. Salt tolerance of transgenic rice overexpressing yeast mitochondrial Mn-SOD in chloroplasts[J]. Plant Science， 1999， 148（2）： 131-138.

[6] FOYER C H， DESCOURVIERES P， KUNERT K J. Protection against oxygen radicals： an important defence mechanism studied in transgenic plants[J]. Plant Cell and Environment，1994，17（5）： 507-523.

[7] FRIDOVICH I. Superoxide dismutases[J]. Annual Review of Biochemistry， 1975， 44： 147-149.

[8] GUAN Jun-feng， GUAN Xue-qiang， GAO Hua-jun， SHU Huai-rui. effects of maturity and postharvest treatment on quality， superoxide dismutase activity and soluble protein content in strawberry fruits[J]. Journal of Fruit Science. 1997， 14（1）： 24-27.

關(guān)軍鋒， 管雪強(qiáng)， 高華君， 束懷瑞. 成熟度和采后處理對(duì)草莓品質(zhì)、SOD活性和蛋白質(zhì)含量的影響[J]. 果樹科學(xué)， 1997， 14（1）： 24-27.

[9] CHEN Wei-hui， ZHANG Fu-ping. The physiological changes of annona squamosa fruit during postharvest Storage[J]. Plant Physiology Communications， 2000， 36（2）： 114-118.

陳蔚輝， 張福平. 番荔枝采后貯藏期問的生理變化[J]. 植物生理學(xué)通迅， 2000， 36（2）： 114-118.

[10] YANG Jian-ping， HAN Tao， LI Li-ping， CHEN Xiao-ning. Effects of heat treatment on membrane-lipid peroxidation of peach fruit during storage[J]. Acta Horticultural Sinica， 1996， 23（1）： 89-90.

楊劍平， 韓濤， 李麗萍， 陳小寧. 熱處理對(duì)桃貯藏期間膜脂過氧化作用的影響[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 1996， 23（1）： 89-90.

[11] ZHANG Yi-feng， TANG Shan-hu， QIN Wen-ling， ZHANG Wei， XIE Fang. Copper zinc superoxide dismutase research progress[J]. Sichuan Animal & Veterinary Sciences， 2008（1）： 33-35.

章軼鋒， 唐善虎， 秦文玲， 張巍， 謝芳. 銅鋅超氧化物歧化酶的研究進(jìn)展[J]. 四川畜牧獸醫(yī)， 2008（1）： 33-35.

[12] LIN Qing-bin， LIAO Sheng-rong， XIONG Ya-hong， LE Xue-yi. Progress in the study and application of superoxide dismutase[J]. Chemical World， 2006（6）： 378-381.

林慶斌， 廖升榮， 熊亞紅，樂學(xué)義. 超氧化物歧化酶的研究和應(yīng)用進(jìn)展[J]. 化學(xué)世界， 2006（6）： 378-381.

[13] SOHAL R S， AGARWAL A， AGARWAL S， ORR W C. Simultaneous Overexpression of Copper-and Zinc-containing Superoxide Dismutase and Catalase Retards Age-related Oxidative Damage and Increases Metabolic Potential in Drosophila melanogaster[J]. Journal of Biological Chemistry， 1995， 270（26）： 15671-15674.

[14] HU Gen-hai， YU Shu-xun， FAN Shu-li， SONG Mei-zhen. Cloning and Expression of the Chloroplast Copper/Zinc-Superoxide Dismutase Gene in Upland Cotton（Gossypium hirsutum L.）[J]. Journal of Plant Physiology and Molecular Biology， 2007， 33（3）： 197-204.

[15] CONG Hai-feng， XU Shi-qing， SIMA Yang-hu， ZHANG Sheng-xiang， WANG Geng-xian， DONG Hang， LIU Ying， LIU Xue-guang. Cloning， analysis and expression of Copper/Zinc superoxide dismutase from wild silkworm， Bombyx mandarina[J]. Science of Sericulture， 2007， 33（2）： 234-240.

叢海峰， 徐世清， 司馬楊虎， 張升祥， 王更先， 董 航， 劉 瑩， 柳學(xué)廣， 野桑蠶銅鋅超氧化物歧化酶基因的克隆分析與原核表達(dá)[J]. 蠶業(yè)科學(xué)， 2007， 33（2）： 234-240.

[16] WANG Fang， DONG Le， DAI Cong-jie，LIN Luan，LIN Jing. Cloning， Analysis and Expression of Copper/Zinc Superoxide Dismutase From Wild Silkworm， Bombyx mandarina[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2010， 26（22）： 27-33.

王芳， 董樂， 戴聰杰，林孌，林靜. 楊梅Cu/Zn超氧化物歧化酶基因（MrSOD1） cDNA的克隆及表達(dá)分析[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2010， 26（22）： 27-33.

[17] SRIKRISHNA MAHANTY，TANUSHRI KAUL，PRACHI PANDEY， RAMESHA A. REDDY， GARLADINNE MALLIKARJUNA， CHINREDDY S. REDDY， SUDHIR K. SOPORY， MALIREDDY K. REDDY. Biochemical and molecular analyses of copper–zinc superoxide dismutase from a C4 plant Pennisetum glaucum reveals an adaptive role in response to oxidative stress[J]. Gene， 2012， 505： 309-317.

[18] ZHOU Yu-chan， TAN Xing-jie. Mechanism of blackheart development induced by low temperature and gibberellic acid in pineapple fruit[J]. Acta Phytophysiologica Sinica， 1992， 18（4）： 341-346.

周玉蟬， 譚興杰. 低溫與GA3誘導(dǎo)菠蘿黑心病的生理機(jī)制[J]. 植物生理學(xué)報(bào)， 1992， 18（4）： 341-346.

[19] SONG Chun-peng，MEI Hui-sheng，CHU Zhong-xi，CHENG Yan-li. Effects of calcium on the generation of superoxid free radical and the conversion of ACC to ethylene by wheat chloroplasts[J]. Acta Phytophysiologica Sinica， 1992， 18（1）： 55-58.

宋純鵬， 梅慧生， 儲(chǔ)鐘稀， 程艷麗. Ca2+對(duì)葉綠體中超氧自由基產(chǎn)生以及由ACC形成乙稀的影響[J]. 植物生理學(xué)報(bào)， 1992， 18（1）： 55-58.

[20] BADAWI G H，YAMAUCHI Y，SHIMADA E，ASAKI R，KAWANO N， TANAKA K. Enhanced tolerance to salt stress and water deficit by overexpressing superoxide dismutase in tobacco （Nicotiana tabacum） chloroplasts[J]. Plant Sci， 2004， 166（4）： 919-928.

[21] WANG Yu-guang， GUO Jian-chun， ZHENG Xue-qin. High Level Expression of Cu/Zn SOD of Tomato in Escherichia Coli[J]. Chinese Journal of Tropical Crops， 1995， 16（Suppl.）： 83-88.

王宇光， 郭建春， 鄭學(xué)勤. 西紅柿Cu/Zn SOD基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的研究[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 1995， 16（增刊）： 83-88.

[22] DONG Le. Prokaryotic expression of copper Zinc-Superoxide dismutase gene （MrCu/Zn-SOD1） from morella rubra and its enzymatic activity detection[J]. Genomics and Applied Biology， 2012， 31（4）： 349-354.

董樂. 楊梅銅鋅超氧化物歧化酶基因（MrCu/Zn-SOD1）的原核表達(dá)及活性鑒定[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2012， 31（4）： 349-354.

[23] BAO Yong-bo， LI Li， XUE Fei， ZHANG Guo-fan. Intracellular copper/zinc superoxide dismutase from bay scallop Argopecten irradians： Its gene structure， mRNA expression and recombinant protein [J]. Fish and Shellfish Immunology， 2009， 27（2）： 210-220.

[24] WANG Shu-fang， YIN Wen-xuan， ZHAO Yan-xiu， ZHANG Hui. Cloning of tobacco manganese superoxide dismutase CDNA gene and its expression in escherichia coli[J]. Journal of Shandong Normal University： Natural Science Edition， 2001， 16（3）： 301-304.

王淑芳， 殷文璇， 趙彥修， 張慧. 煙草MnSOD cDNA 基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)[J]. 山東師大學(xué)報(bào)： 自然科學(xué)版， 2001， 16（3）： 301-304.

[25] WANG Yi-hua， XU Mei-zhen， DANG Yun-kun， CHEN Jia. Prokaryotic expression， purification and antiserum preparation of arabidopsis MnSOD[J]. Letters in Biotechnology， 2004， 15（2）： 112 -114.

王義華， 徐梅珍， 黨云琨， 陳珈. 擬南芥MnSOD 的原核表達(dá)、純化及抗體制備[J]. 生物技術(shù)通訊， 2004， 15（2）： 112-114.

[26] GAO Jian， XU Xiao-feng， CHEN Xue-ping. Cloning and expression of Fe-SOD gene from a native Chinese tobacco variety HZNH[J]. Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology， 2005， 21（6）： 840-845.

高健， 許曉風(fēng)， 陳學(xué)平. 特異種質(zhì)煙草HZNH 的Fe-SOD 基因的克隆與表達(dá)[J]. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)， 2005， 21（6）： 840 -845.