梨腐爛病致病力的室內(nèi)快速測定方法研究

張美鑫 翟立峰等

摘 要： 【目的】為了研究建立我國梨腐爛病致病力室內(nèi)快速、穩(wěn)定的測定方法，【方法】以‘豐水梨的離體枝條、葉片、嫩梢和果實為材料，采用不同方法造成傷口后接種梨腐爛病的強致病力菌株F-AH-3a，在25 ℃下保濕培養(yǎng)后觀測各處理的發(fā)病程度，并在‘豐水梨和‘康德梨上用梨腐爛病致病力已知的菌株對測定方法進行驗證。【結(jié)果】葉片傷口接種，葉正面的病斑較背面的大，經(jīng)6針與1和3針刺傷處理產(chǎn)生的病斑大小之間存在顯著性差異；嫩梢和果實傷口接種，不同處理產(chǎn)生的病斑大小之間無顯著性差異；枝條傷口接種3d后，經(jīng)打孔、環(huán)割、燙打及10針刺傷處理的枝條發(fā)病率均為100%，而經(jīng)3針刺傷、燙傷和芽痕處理的分別為55%、40%和15%。前4種處理病斑的長度顯著大于后3種處理。在‘豐水梨和‘康德梨品種上，用5個梨腐爛病致病力已知菌株對測定方法進行驗證的結(jié)果表明，各菌株通過枝條打孔接種后產(chǎn)生的病斑，在其長度之間的差異與菌株致病力已知的強弱相吻合。【結(jié)論】采用枝條打孔接種法的測定效果顯著、穩(wěn)定，且操作簡單，可用于梨腐爛病菌致病力的室內(nèi)快速測定。

關(guān)鍵詞： 梨腐爛?。?致病力； 室內(nèi)測定； 枝條打孔接種

中圖分類號：S661.2 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪02-0317-06

梨腐爛病主要危害主干、主枝及側(cè)枝，造成樹皮腐爛，其癥狀有潰瘍和枝枯2種類型[1]。該病在我國各梨區(qū)均有分布，尤以東北、華北和西北梨區(qū)危害較重，常造成大量死樹，甚至毀園。梨園腐爛病的發(fā)生數(shù)量和危害程度與梨系統(tǒng)和品種關(guān)系密切，秋子梨（Pyrus ussuriensis Maxim.）基本不發(fā)病，白梨 （P. bretschneideri Rehd.）、沙梨 （P. pyrifolia （Burm.f.） Nakai ）和新疆梨 （P. sinkiangensis Yü）較感病，西洋梨（P. communis L.）發(fā)病最重[2-3]。梨和蘋果腐爛病系由同一病菌的兩個變種所致，即梨腐爛病菌（Valsa mali var. pyri） 和蘋果腐爛病菌（V. mali var. mali）所致[4]，但目前我國對梨腐爛病的研究遠沒有蘋果腐爛病廣泛和深入，對來源于不同梨種類和不同梨產(chǎn)區(qū)的梨腐爛病菌致病力分化特征尚缺乏系統(tǒng)研究，而建立可靠的致病力測定方法是其研究關(guān)鍵。雖然有報道蘋果腐爛病可在室內(nèi)利用針刺接種蘋果葉片或燙傷接種蘋果枝條測定其致病力[5]，但因梨腐爛病與蘋果腐爛病的病原不同[4]，2者在同一寄主和不同寄主上的致病反應(yīng)均存在明顯差異，且生產(chǎn)上梨的栽培范圍和栽培種類較蘋果更為廣泛和繁多，梨腐爛病菌致病力的分化可能更為復(fù)雜，因此需要對梨腐爛病菌致病力的測定方法進行系統(tǒng)研究。

我們以‘豐水梨的離體枝條、葉片、嫩梢和果實為材料，采用不同方法造成傷口后接種梨腐爛病菌的強致病力菌株，觀測各處理的發(fā)病程度，并在‘豐水梨和‘康德梨上用梨腐爛病致病力已知的菌株對測定方法進行驗證，旨在建立梨腐爛病菌室內(nèi)快速、穩(wěn)定且操作簡單的測定方法，為深入研究我國梨腐爛病菌致病力分化、抗性資源評價及防治藥劑篩選奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株和接種材料

依據(jù)在2 a生‘豐水梨（Pyrus pyrifolia ‘Hohsui）上用梨腐爛病菌株進行活體接種的試驗結(jié)果，選取5個致病力已知的菌株： F-HN-6（強致病力菌株）、F-AH-3a（強致病力菌株）、F-LN-5a（中致病力菌株）、F-SHX-1b（中致病力菌株）和F-HN-2a-1（弱致病力菌株）作為本研究的供試菌株。

從華中農(nóng)業(yè)大學(xué)梨園中的‘豐水梨和‘康德梨（Pyrus communis ‘Le Counte）上分別選取長短均勻、含水量一致的1 a生健康枝條、3周齡以上完全展開葉片、1 a生枝條頂端未木質(zhì)化的嫩梢和成熟的果實作為本研究的接種材料。

1.2 接種方法

1.2.1 枝條傷口接種 枝條用無菌水洗凈晾干，經(jīng)75%酒精消毒后將其剪成15 cm小段，兩端用石蠟封口。傷口處理設(shè)有： 無傷、芽痕（用滅菌的解剖刀抹去芽）、3和10針刺傷（用滅菌的解剖針刺傷樹皮，針點均勻分布在直徑5 mm的圓形區(qū)域）、燙傷（用燒熱的直徑5 mm的鐵釘釘帽燙傷）、燙打（用燒熱的直徑5 mm打孔器取下樹皮韌皮部）、打孔（用滅菌的直徑5 mm打孔器取下樹皮韌皮部）、環(huán)割（用滅菌的解剖刀環(huán)割枝條1周）。梨腐爛病強致病力菌株F-AH-3a在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后，用5 mm打孔器從最外緣打取菌絲塊，分別接種于以上傷口處，并在菌絲塊上面覆蓋滴有無菌水的脫脂棉保濕，以空白PDA培養(yǎng)基接種作為對照。接種后的枝條置于白盤中（盤底鋪滴有無菌水的滅菌紗布，盤口覆保鮮膜），在25 ℃條件下培養(yǎng)4 d后測定其病斑的長度。每一接種處理重復(fù)6次，試驗重復(fù)3次。

1.2.2 葉片傷口接種 葉片用無菌水洗凈晾干，葉柄處用滴有無菌水的脫脂棉保濕，傷口處理設(shè)有： 正面無傷、1、3、6和10針刺傷；背面無傷、1、3、6和10針刺傷。菌株、接種方法、對照設(shè)置、病斑測定和重復(fù)次數(shù)同上。

1.2.3 嫩梢傷口接種 嫩梢長約15 cm，剪去葉片（留一部分葉柄），無菌水洗凈晾干，剪口處用滴有無菌水的脫脂棉保濕。傷口處理設(shè)有： 無傷、1針刺傷和葉痕。菌株、接種方法、對照設(shè)置、病斑測定和重復(fù)次數(shù)同上。

1.2.4 果實傷口接種 果實用無菌水洗凈晾干，75%酒精消毒，傷口處理設(shè)有： 無傷、燙傷、1、3和10針刺傷、打孔。菌株、接種方法、對照設(shè)置、病斑測定和重復(fù)次數(shù)同上。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用SPSS.16.0軟件進行分析， 處理間的差異顯著性采用Duncans Multiple Range Test。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法對強致病力菌株的測定結(jié)果

2.1.1 枝條接種法的測定結(jié)果 枝條上無傷口接種F-AH-3a和空白培養(yǎng)基接種均未發(fā)病。有傷枝條接種F-AH-3a ，接種2 d后在傷口處開始出現(xiàn)黃褐色病斑，病健交界明顯，之后逐漸形成外圍黑色、中間黃褐色的輪紋狀褶皺病斑，且發(fā)病部位向下凹陷（圖版A1～A8）。其中接種3 d時的發(fā)病率，經(jīng)打孔、環(huán)割、打燙和10針刺傷處理的均為100%，燙傷處理的為40%，3針刺傷處理的為55%，芽痕處理的為15%。接種7 d后整個枝條軟化腐爛，并開始形成黑色分生孢子器，接種20 d后有黃色分生孢子角泌出。

對枝條經(jīng)不同傷口接種4 d后的病斑長度統(tǒng)計分析的結(jié)果顯示經(jīng)10針刺傷、燙打、打孔和環(huán)割四種處理的病斑長度明顯大于燙傷、3針刺傷和芽痕3種處理的病斑長度，其差異性顯著，但前四種處理的病斑長度之間無顯著性差異。

2.1.2 葉片接種法的測定結(jié)果 葉片上無傷口接種F-AH-3a和空白培養(yǎng)基接種均未發(fā)病。有傷口葉片接種F-AH-3a，接種1 d后針孔處均變褐色，且經(jīng)6針刺傷和10針刺傷處理的病斑超出菌餅，之后病斑逐漸變黑，形成中間黃褐色，外圍黑色與黃色交替的輪紋近圓形病斑（圖版B1～C5）。在葉片正面接種產(chǎn)生的病斑較在背面接種產(chǎn)生的病斑大。接種5 d后葉片上開始形成黑色的分生孢子器，孢子器上面覆蓋有白色的菌絲，之后分生孢子器數(shù)量逐漸增加，接種10 d后出現(xiàn)黃色的分生孢子角。

對葉片經(jīng)不同傷口接種2 d后的病斑直徑統(tǒng)計分析的結(jié)果顯示經(jīng)6針和10針刺傷處理產(chǎn)生的病斑直徑較大，與1針和3針刺傷處理產(chǎn)生的病斑在直徑大小上存在顯著性差異，但在葉片正面接種產(chǎn)生的病斑與在葉片背面接種產(chǎn)生的病斑在直徑大小上不存在顯著差異性。

2.1.3 嫩梢接種法的測定結(jié)果 嫩梢上無傷口接種F-AH-3a和空白培養(yǎng)基接種均未發(fā)病。有傷口嫩梢接種F-AH-3a，接種12 h后經(jīng)1針刺傷處理的嫩梢能夠看到黑色病斑，但病斑未超出菌餅，經(jīng)葉痕處理的嫩梢在接種處變褐，病斑無擴展，接種1 d后經(jīng)1針刺傷與葉痕處理的嫩梢均出現(xiàn)黑色病斑，且病斑超出菌餅。之后病斑逐漸擴大，使整個嫩梢變黑腐爛。接種7 d后嫩梢上出現(xiàn)分生孢子器，其上覆蓋大量白色菌絲，接種12 d后有黃色分生孢子角泌出。

對嫩梢經(jīng)不同傷口接種2 d后的病斑長度統(tǒng)計分析的結(jié)果顯示經(jīng)針刺處理與葉痕處理的病斑長度相近，不存在顯著性差異。

2.1.4 果實接種法的測定結(jié)果 果實上無傷口接種F-AH-3a和空白培養(yǎng)基接種均未發(fā)病。有傷口果實接種，接種12 h后經(jīng)1針刺傷、3針刺傷和10針刺傷處理的均在針刺處出現(xiàn)黃色病斑，但經(jīng)打孔和燙傷處理的未觀察到病斑。接種1 d后經(jīng)各種傷口處理產(chǎn)生的病斑均超出菌餅，病斑圓形，外緣黑色、中間黃色。接種4 d后果實組織軟化，接種7 d后果實開始腐爛，但一直未出現(xiàn)分生孢子器。

對果實經(jīng)不同傷口接種2 d后的病斑直徑統(tǒng)計分析的結(jié)果顯示經(jīng)各種處理產(chǎn)生的病斑在直徑大小相近，不存在顯著性差異。

2.2 用致病力已知菌株對測定方法的驗證結(jié)果

在‘豐水梨上，采用5個致病力已知的梨腐爛病菌株對4種接種方法進行驗證的結(jié)果顯示，除空白培養(yǎng)基接種未發(fā)病外，5個菌株均產(chǎn)生大小不同的病斑（圖版D1～D6）。在枝條、嫩梢和葉片上2個強致病力菌株F-HN-6和F-AH-3a所產(chǎn)生的病斑最大，其病斑差異不顯著；2個中致病力菌株 F-LN-5a和F-SHX-1b所產(chǎn)生的病斑大小次之，弱致病力菌株F-HN-2a-1所產(chǎn)生的病斑最小。在枝條和葉片上，強、中、弱致病力菌株所產(chǎn)生的病斑大小之間差異顯著。在嫩梢上，中與強致病力菌株所產(chǎn)生的病斑大小之間差異不顯著。在果實上，弱致病力菌株所產(chǎn)生的病斑最大，與該菌株實際的毒力大小不相符合（表1）。

在‘康德梨上，采用5個致病力已知的梨腐爛病菌株對4種接種方法進行驗證的結(jié)果顯示，除空白培養(yǎng)基接種未發(fā)病外，5個菌株均產(chǎn)生大小不同的病斑（圖版E1～E6）。在枝條、嫩梢和葉片上，2個強致病力菌株F-HN-6和F-AH-3a所產(chǎn)生的病斑最大，其病斑大小差異不顯著；2個中致病力菌株 F-LN-5a和F-SHX-1b所產(chǎn)生的病斑大小次之；弱致病力菌株F-HN-2a-1所產(chǎn)生的病斑最小。在枝條和嫩梢上，強、中、弱致病力菌株所產(chǎn)生的病斑大小之間差異顯著。在葉片上，中與強致病力菌株所產(chǎn)生的病斑大小之間差異不顯著。在果實上，弱與中和強致病力菌株所產(chǎn)生的病斑大小之間差異不顯著，這與弱菌株的實際毒力大小不相符合（表2）。

3 討 論

果樹（梨、蘋果、山楂、桃、杏）和林木（桉樹、楊樹、柳樹、槐樹）腐爛病的病原菌均為弱寄生菌，在田間通過傷口（剪鋸口、裂口、日灼、凍傷）侵入樹體，因此腐爛病菌致病力的測定，不論是田間活體接種，還是室內(nèi)離體材料接種，均需在接種部位造成傷口。傷口類型、接種部位和接種材料的不同均可影響到病原菌致病力的測定結(jié)果。

Adams等[6]利用枝條燙傷接種法對桉樹腐爛病菌的致病力進行了測定，Abe等[7-8]通過在枝條上燙傷后接種蘋果腐爛病菌進行蘋果抗性種質(zhì)資源的篩選和評價，臧瑞等[9]利用枝條燙傷接種法證實陜西地區(qū)的蘋果腐爛病菌存在不同致病力的菌株。韋潔玲等[5]利用蘋果的不同組織材料對蘋果腐爛病菌不同致病力菌株進行驗證，發(fā)現(xiàn)嫩梢、葉片和果實的測定結(jié)果與枝條燙傷接種法的結(jié)果一致。但Bessho等[10]研究認為燙傷時間的一致性很難把握，而燙傷時間上的差異對其測定結(jié)果影響很大。Bessho等[11]通過在蘋果枝條上造成楔形傷口接種病菌菌絲塊鑒定種質(zhì)資源對蘋果腐爛病的抗性，劉欣穎等[12]通過枝條打孔法接種蘋果腐爛病菌分生孢子懸浮液評價蘋果種質(zhì)資源對蘋果腐爛病的抗性。

梨腐爛病與蘋果腐爛病的病原在rDNA-ITS核苷酸序列、培養(yǎng)特征和致病特性上均存在差異，已有研究發(fā)現(xiàn)蘋果腐爛病菌（V. mali var. mali） 僅侵染蘋果，而梨腐爛病菌（Valsa mali var. pyri） 可侵染梨和蘋果[4]，本實驗室從我國15個梨產(chǎn)區(qū)采集的腐爛病樣品中分離獲得的168個菌株經(jīng)鑒定均為梨腐爛病菌，未鑒定出蘋果腐爛病菌，并發(fā)現(xiàn)在‘翠冠梨枝條上梨腐爛病菌的致病力強于蘋果腐爛病菌，而在‘富士蘋果枝條上蘋果腐爛病菌的致病力強于梨腐爛病菌株[13]。但有關(guān)梨腐爛病菌致病力的室內(nèi)快速測定方法的研究至今尚無報道，對來源于不同梨種類和不同梨產(chǎn)區(qū)的梨腐爛病菌致病力分化特征也缺乏系統(tǒng)研究。

本研究在‘豐水梨不同組織材料上采用不同接種方法對梨腐爛病強致病力菌株所產(chǎn)生的病斑大小進行了測定，并在‘豐水梨和‘康德梨上用梨腐爛病致病力已知的菌株對不同測定方法進行了驗證。研究結(jié)果表明，梨腐爛病菌室內(nèi)致病力測定的效果因接種材料和傷口處理方式的不同存在顯著差異。采用1 a生枝條作為接種材料時，不同菌株在2個接種品種上所產(chǎn)生的病斑大小之間差異顯著，均與田間活體接種結(jié)果一致；采用3周齡以上完全展開葉片和頂端未木質(zhì)化的嫩梢，不同菌株所產(chǎn)生的病斑大小之間的差異隨接種品種的不同而異；采用成熟的果實，不同菌株產(chǎn)生的病斑大小之間的差異不顯著，測定結(jié)果與田間活體接種結(jié)果不一致，因此選擇1 a生枝條作為梨腐爛病菌致病力測定的接種材料。在枝條的傷口處理方式上，經(jīng)打孔、10針刺傷、燙打和環(huán)割4種處理產(chǎn)生的病斑大小之間無顯著性差異，但與芽痕、3針刺傷和燙傷法這3種處理所產(chǎn)生的病斑大小之間存在顯著性差異，在前4種處理中枝條打孔操作簡單，故選其為梨腐爛病菌致病力測定的傷口處理方式。

當(dāng)采用枝條打孔接種法測定梨腐爛病菌致病力的強弱時，為保證其測定結(jié)果的準確性，根據(jù)本試驗的研究，需對接種體、接種枝條和培養(yǎng)條件進行選擇和控制。在我們的前期預(yù)備試驗中，在梨枝條上多次采用梨腐爛病菌的分生孢子懸浮液進行活體和離體接種，結(jié)果發(fā)病率均很低，因此接種體以選取PDA培養(yǎng)基最外緣病菌生長最旺盛的菌絲塊為宜。接種枝條則需選取梨同一品種同株樹上長勢相同的1 a生健康枝條，剪成長短均勻的小段，兩端用石蠟封口，使其含水量保持一致。此外，傷口接種后的培養(yǎng)需在保濕控溫條件下進行。即在接種的菌絲塊上面覆蓋滴有滅菌水的脫脂棉保濕，將已接種的枝段置于白塑料盤中培養(yǎng)，盤底鋪上滴有無菌水的滅菌紗布，盤口用保鮮膜封閉。培養(yǎng)溫度控制在25 ℃。梨腐爛病菌致病力室內(nèi)測定方法的建立，可為進一步深入研究我國不同梨產(chǎn)區(qū)和不同梨種類上腐爛病菌致病力的分化狀況和梨對腐爛病的抗性資源及防治藥劑的篩選奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究根據(jù)‘豐水梨葉片、嫩梢、枝條和果實通過不同傷口接種梨腐爛病強致病力菌株所產(chǎn)生病斑長度的測定結(jié)果，以及在‘豐水梨和‘康德梨上用致病力已知的梨腐爛病菌株對測定方法的驗證結(jié)果，認為采用枝條打孔接種法，測定效果顯著、穩(wěn)定，且操作簡單，可用于梨腐爛病菌致病力的室內(nèi)快速測定。（本文圖版見封3）

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