三種葡萄病毒的RT—PCR檢測和系統(tǒng)進(jìn)化分析

王建輝 劉建軍等

摘 要： 【目的】為了研究不同葡萄病毒病快速檢測方法和四川分離株系統(tǒng)進(jìn)化，【方法】比較3種葡萄總RNA提取方法，還優(yōu)化了葡萄病毒病的RT-PCR檢測方法。分別克隆了3種病毒四川分離株的部分基因組區(qū)域，并開展了系統(tǒng)進(jìn)化分析?！窘Y(jié)果】結(jié)果表明，改進(jìn)硅膠顆粒吸附法快速從葡萄枝條的韌皮組織中提取了總RNA，并以葡萄18S RNA為內(nèi)參基因，RT-PCR分別成功擴(kuò)增出3種病毒的目的片段。把16個(gè)地理起源的GLRaV-2分離株的外殼蛋白基因（Coat protein， CP）分成5個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化組。而7個(gè)地理起源的GVB分離株CP同源性為79.1%～98.7%。此外，5個(gè)GVA四川分離株分別位于系統(tǒng)進(jìn)化樹的4個(gè)聚類群?！窘Y(jié)論】GLRaV-2、GVB和GVA不同地理起源的分離株在核酸水平上具有變異性，其中GVA四川分離株之間具有顯著的遺傳差異，可能包括4種株系。

關(guān)鍵詞： 葡萄卷葉伴隨2型病毒； 葡萄B病毒； 葡萄A病毒； 病毒外殼蛋白基因； 病毒沉默抑制子基因

中圖分類號(hào)：S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪02-0197-05

葡萄是一種在全世界栽培面積大、產(chǎn)量高的重要果樹。帶毒種苗與昆蟲介體的傳播造成了葡萄病毒病在全世界廣泛流行，嚴(yán)重地影響葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。葡萄可被多種RNA病毒感染并產(chǎn)生不同癥狀。葡萄卷葉伴隨2型病毒（Grapevine leafroll associated virus-2， GLRaV-2）與砧木嫁接不親和癥狀有關(guān)。GLRaV-2種群分為5個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化組，各個(gè)變異組內(nèi)的分離物具有不同致病性[3]。葡萄B病毒（Grapevine Virus B， GVB）是葡萄粗皮病的主要病原物，GVB種群也包含多種變異株[4]。葡萄A病毒（Grapevine virus A， GVA）與皺木復(fù)合病有密切關(guān)系，包含了系統(tǒng)進(jìn)化I、II、III組的變異株系[5]。

近年來，全國葡萄種植新區(qū)的建立和栽培面積的擴(kuò)大，不同品種的扦插苗在各地的引進(jìn)和輸出也日益頻繁，不科學(xué)的栽培技術(shù)，被感染種苗的擴(kuò)散和帶毒昆蟲的傳播，造了成各種葡萄病毒病在四川、山東、湖北等地的發(fā)生[6-8]。本文進(jìn)一步優(yōu)化了葡萄總RNA提取方法和3種葡萄病毒病RT-PCR快速檢測技術(shù)，并分別克隆了GLRaV-2、GVB和GVA四川分離株的部分基因組序列。利用核酸數(shù)據(jù)庫（NCBI）已知分離物核酸序列，分別開展了3種病毒的系統(tǒng)進(jìn)化研究。開展葡萄病毒RT-PCR快速檢測與病毒系統(tǒng)進(jìn)化研究，以期為葡萄無病毒苗木生產(chǎn)與葡萄病毒病防控提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

在四川省歐美雜交鮮食葡萄（Vitis vinifera L.×V. labrusca L.）主產(chǎn)區(qū)分別采集‘京早晶與‘藤稔的1 a生成熟枝條，開展枝條韌皮部為材料提取總RNA研究。另外，‘藤稔（1株）、‘無核王子（2株）、‘希姆勞特（1株）、“南抗一號(hào)”（1株），用于GVA遺傳多樣性研究。

1.2 DAS-ELISA檢測與Western blot雜交

DAS-ELISA檢測試劑盒購自意大利Agritest ，參考試劑盒說明檢測GLRaV-2、GVB和GVA，待測樣本OD405吸收光值是陰性對照的3倍被認(rèn)為是ELISA陽性，用“+”表示，陰性樣本用“-”表示。參照Sambrook方法[9]，分別對‘京早晶與‘藤稔進(jìn)行Western blot檢測GLRaV-2、GVB和GVA（Sadarelli博士饋贈(zèng)特異病毒抗血清）。

1.3 總RNA提取與RT-PCR檢測

根據(jù)核酸數(shù)據(jù)庫（NCBI）已知GLRaV-2基因組核酸序列（NC007448，DQ286725和AY881628），GVB基因組核酸序列（NC003602）和GVA基因組核酸序列（DQ855084，DQ855082和DQ855088），利用軟件（DNAMAN 5.2.2）分別設(shè)計(jì)用于3種病毒部分基因組區(qū)域擴(kuò)增的上、下游簡并引物

取大約200 mg的‘京早晶（1號(hào)）與‘藤稔（2號(hào)）的1 a生成熟枝條韌皮部，分別采用3種方法提取總RNA，即熱酚法[10]、LiCl法[11]，改進(jìn)的硅膠顆粒吸收法[12]。其中“硅膠顆粒吸收法”，在加入硅膠前的步驟與文獻(xiàn)[12]相同。改進(jìn)部分為： 室溫硅膠顆粒吸附總核酸60 min，不間斷振蕩5次。7 000 r·min-1室溫離心 1 min，洗滌緩沖液洗滌沉淀后溶于50 μL的DEPC處理水中。DNA酶處理總核酸后，Tris飽和酚與等體積的氯仿/異戊醇抽提得總RNA。13 000 r·min-1 4 ℃離心10 min，取上清加入等體積的異丙醇。室溫靜置10 min，13 000 r·min-1 4 ℃離心10 min。75%乙醇洗滌沉淀后，溶解于50 μL的DEPC處理水中。取500 ng葡萄總RNA和500 ng的6堿基隨機(jī)引物，使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa， 大連）合成cDNA第1條鏈。參照文獻(xiàn)[13]擴(kuò)增體系： cDNA 2 μL，Buffer 5×2.5 μL，MgCl2（25 mmol·L-1）1.5 μL，dNTP（2.5 mmol·L-1）1.0 μL，上下游引物各（10 μmol·L-1）0.5 μL，Tag酶0.5 μL，ddH2O 16.5 μL。分別對3種方法獲得1號(hào)與2號(hào)樣本的葡萄18s RNA和3種病毒目標(biāo)基因組區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增： 94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 S，61 ℃復(fù)性45 S，72 ℃延伸1 min，共計(jì)35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。在1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果并照相記錄。

1.4 3種葡萄病毒部分基因組區(qū)域克隆

分別取‘藤稔葡萄的GLRaV-2，GVB和GVA的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4.5 μL，線性化載體pMD19-T（TaKaRa， 大連）0.5μL，T4 DNA Ligase Mix 1.5μL（TaKaRa， 大連），14 ℃過夜連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)菌（TIANGEN，北京），提取陽性克隆質(zhì)粒并測序。同樣對‘無核王子（2株）、‘希姆勞特（1株）、“南抗一號(hào)”（1株）的GVA的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測序[14]。

1.5 3種病毒的四川分離株的系統(tǒng)進(jìn)化分析

GenBank中獲得15個(gè)不同地理來源的GLRa V-2分離株CP（Coat protein， CP）全長序列（NCBI登錄號(hào)： EF012720、 NC004724、 EF012718、 EF012721、EF012717、 AY697863、 AY881628、 DQ314588、DQ314603、 AY842932、 DQ314591、 AF039204、DQ314604、Y14131、AY697863），6個(gè)不同地理來源的GVB分離株CP全長序列（NCBI登錄號(hào)： NC003602、 AY340582、 AY340583、 AF438410、 AB039842、EF583906）， 和來至于3個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化組的GVA代表分離株[5]的基因組全長序列 [（Ⅰ組： GTG11-1（DQ855084） 和IS151（NC003604）；Ⅱ組： P163-M5（DQ855082）和GTR1SD-1（DQ855081）；Ⅲ組： GTR1-1（DQ787959 ）和P163-1（DQ855088）]。

DNAStar軟件進(jìn)行多重比對（ClustalW方法），分析不同分離株間的核酸序列相似性。Mega 3.1（Center for Evolutionary Functional Genomics， 美國）軟件采用鄰接法（設(shè)定1000重復(fù)值的bootstrap評(píng)估遺傳距離分枝的可信度）構(gòu)建不同地理起源分離株的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 DAS-ELISA檢測與Western blot雜交

DAS-ELISA分別檢測‘京早晶（1號(hào)樣本）與‘藤稔（2號(hào)樣本）。2號(hào)樣本的DAS-ELISA檢測結(jié)果為GLRaV-2，GVB和GVA陽性，而1號(hào)樣本的3種病毒病檢測結(jié)果都是陰性（圖1）。同時(shí)，Western Blot得到與之一致的檢測結(jié)果。2號(hào)樣本分別有大約24 kDa、22 kDa與22 kDa的3種病毒免疫反應(yīng)條帶（雜交條帶分子質(zhì)量分別與病毒外殼蛋白核酸序列的預(yù)測分子質(zhì)量相似），而1號(hào)樣本沒有相應(yīng)大小的雜交條帶（圖1）。因此2號(hào)樣本被GLRaV-2，GVB和GVA 3種病毒復(fù)合感染，將用于3種四川葡萄病毒的快速RT-PCR檢測與系統(tǒng)進(jìn)化研究。而1號(hào)樣本是健康對照植株，沒有被3種待測病毒感染。同時(shí)，‘無核王子、‘希姆勞特、‘南抗一號(hào)經(jīng)過DAS-ELISA檢測都是GVA陽性，將用于GVA四川分離株的系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2.2 比較3種葡萄總RNA提取方法

3種方法都可以從成熟枝條韌皮部組織中提取總RNA，包含葡萄的28S和18S rRNA條帶但是方法1與方法2提取的總RNA為模板，RT-PCR不能擴(kuò)增出大約670 bp的葡萄18s RNA目標(biāo)條帶。只有方法3（改進(jìn)“硅膠顆粒吸收法”提取總RNA）提取的總RNA為模板，成功擴(kuò)增出大約670 bp目的條帶（圖2）。以方法3獲得‘藤稔（2號(hào)樣本）的總RNA為反轉(zhuǎn)錄模板，RT-PCR分別擴(kuò)增獲得GLRaV-2約600 bp 、GVB 的600 bp 和GVA的900 bp目標(biāo)產(chǎn)物1號(hào)樣本無相應(yīng)產(chǎn)物（數(shù)據(jù)略）。

2.3 GLRaV-2系統(tǒng)進(jìn)化分析

克隆‘藤稔GLRaV-2四川分離株的外殼蛋白基因全長序列（597 bp），命名為“SL10分離株”（NCBI 登錄號(hào)DQ91147）。16個(gè)不同地理起源的GLRaV-2分離株的CP聚類結(jié)果，包括5個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化組（圖3）。所有組間GLRaV-2分離物核酸序列只有72.9%～77.2%同源性，而各組內(nèi)分離物之間高達(dá)86.4%～100%的同源性（數(shù)據(jù)略）。四川分離物（DQ911174）和湖北分離物（AY842932）都位于I組內(nèi)。II組（AY697863）和III組（EF012718）只包含一個(gè)分離株。IV組包含2個(gè)分離株（EF012720與NC004724）。V組包含2個(gè)分離株（EF012717與EF012721）。

2.4 GVB系統(tǒng)進(jìn)化分析

克隆‘藤稔GVB分離株的外殼蛋白基因全長序列（594 bp），命名為“SL10分離株”（NCBI登錄號(hào)DQ911146）。7個(gè)不同地理起源的GVB分離株CP同源性為79.1%～98.7%，（數(shù)據(jù)略）。四川與日本分離株（AB039842）的核酸同源性高達(dá)96.8%，并聚在一個(gè)進(jìn)化支內(nèi)

2.5 GVA系統(tǒng)進(jìn)化分析

分別對1株‘藤稔、2株‘無核王子、1株‘希姆勞特和1株‘南抗一號(hào)的GVA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了克隆和測序，擴(kuò)增產(chǎn)物全長均為839 bp。除去上下游引物（40 bp）和3末端非翻譯區(qū)（43 bp）外，包括部分外殼蛋白基因（483 bp）和全長RNA沉默抑制子基因（273 bp），分別命名為分離株SL10、WHWZ5和WHWZ3、PZH28及NKYH，NCBI登錄號(hào)分別為HQ671645、 HQ671659、 HQ671649、 HQ671639和HQ671665。系統(tǒng)進(jìn)化分析的結(jié)果顯示，其中3個(gè)GVA分離物（HQ671649，HQ671665和HQ671639）分別聚在組I、II和III（圖5）。另外2個(gè)GVA分離物（HQ671659與HQ671645）單獨(dú)聚在一起，命名為組IV。這2個(gè)GVA分離物與其他3個(gè)組的代表分離物的外殼蛋白基因的核酸同源性為80.1%～87.4%；沉默抑制子同源性為85.3%～91.9%。而2個(gè)GVA分離株間外殼蛋白基因同源性為99%；沉默抑制子為100%（數(shù)據(jù)略）。

3 討 論

“熱酚提取RNA法”與“LiCl提取RNA法”都可能不能除去成熟枝條韌皮部中的多糖、多酚等雜質(zhì)對后續(xù)反應(yīng)的影響。這2種方法分別以歐洲葡萄葉脈組織（V. vinifera L.）和本氏煙草葉片（Nicotiana benthamiana）為材料提取總RNA，開展病毒基因的RT-PCR擴(kuò)增。采用前2種方法提取的韌皮部組織總RNA為模板，不能得到內(nèi)參基因的擴(kuò)增條帶。而采用“硅膠吸收法”成功擴(kuò)增出內(nèi)參基因和病毒基因組目標(biāo)區(qū)域，全程耗時(shí)5 h左右。以宿主的18s RNA為內(nèi)參基因可以初步鑒定總RNA質(zhì)量，保證最后檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究建立了3種葡萄病毒的RT-PCR快速檢測方法，為以后開展病毒多重RT-PCR檢測研究打下了基礎(chǔ)。

本研究中，GLRaV-2四川與湖北分離株的外殼蛋白基因聚在同一個(gè)進(jìn)化支內(nèi)（核酸與氨基酸同源性高達(dá)99%），湖北分離株與卷葉致病株系有關(guān)[15]。四川與湖北分離株位于系統(tǒng)進(jìn)化I組，Bertazzon等[16]認(rèn)為此組內(nèi)的GLRaV-2變異株在全世界廣泛分布并且誘導(dǎo)植株產(chǎn)生嫁接不親和與卷葉癥狀。據(jù)報(bào)道在四川一株鮮食葡萄上復(fù)合侵染了分別來自3個(gè)進(jìn)化組的GVA變異株[17]，而湖北和遼寧的20余個(gè)GVA分離株都來至于一個(gè)株系（系統(tǒng)進(jìn)化I組）[18-19]。本研究中，來自四川不同產(chǎn)區(qū)的4個(gè)歐美雜交鮮食葡萄品種（V. vinifera L.×V. labrusca L.）上分離得到的5個(gè)GVA分離株之間遺傳差異大，分別位于4個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化組。這與從歐亞種釀酒葡萄（V. vinifera L.）分離的GVA意大利種群結(jié)構(gòu)一致[20]。本研究對3種葡萄病毒進(jìn)行了遺傳變異和系統(tǒng)進(jìn)化研究，為四川葡萄病毒病流行與防控的緊迫性提供了理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

快速RT-PCR成功檢測了3種葡萄病毒。GLRaV-2、GVB和GVA不同地理起源的分離株在核酸水平上具有變異性，其中GVA四川分離株之間具有顯著的遺傳差異，可能包括4種株系。

參考文獻(xiàn) References：

[1] LEE JUNGMIN， MARTIN R . Influence of grapevine leafroll associated viruses （GLRaV-2 and -3） on the fruit composition of Oregon Vitis vinifera L. cv. Pinot noir： Phenolics[J]. Food Chemistry，2009， 112： 889-896.

[2] GARAU R，CUGUSI M， DORE M， PROTA U. Investigations on the yield of ‘Monica and ‘Italiavines affected by legno riccio（stem pitting）[J]. Phytopathol Mediterr， 1985， 24： 64-67.

[3] MENG B， LI C， GOSZYNSKI D E. Genome sequences of two biologically distinct strains of grapevine leafroll-associated virus 2 and sequence analysis[J]. Virus Genes， 2005 ， 31： 31-41.

[4] SHI Bu-jun， HABILI N， GAFNY R. Extensive variation of sequence within Isolates of grapevine Virus B[J]. Virus Genes， 2004， 29： 279 -285.

[5] GOSZCZYNSKI D E， PREEZ J D ， BURGER J T. Molecular divergence of Grapevine virus A （GVA） variants associated with Shiraz disease in South Africa[J]. Virus Research，2008， 138： 105-110.

[6] LIU Xiao， CHEN Jian， WANG Jian- hui， LIU Jian- jun. Identification of virus diseases in some gr apevine cultivar s and evaluation of their sanitary state[J]. Journal of Fruit Science， 2006， 23（6）： 846-849.

劉曉， 陳建， 王建輝， 劉建軍. 部分葡萄品種的病毒病鑒定及健康狀況評(píng)價(jià)[J]. 果樹學(xué)報(bào)， 2006，23（6）： 846-849.

[7] PAN Zhi-yong， ZHAI Heng， ZUO Fang-mei， SHI Qi-zhao. The investigation of the main viruses occurrences in grapevine production areas at Shangdong[J]. Plant Protection，2002， 28（6）： 40-42.

潘志勇，翟衡，左方梅，史啟照，山東葡萄產(chǎn)區(qū)主要病毒病發(fā)生危害調(diào)查[J]. 植物保護(hù)，2002，28（6）： 40-42.

[8] LIU Yong-qing， WANG Guo-ping. Techniques for detecting grapevine virus[J]. Sino-overseas Grapevine & Wine， 2004（4）： 27-28.

劉永清，王國平，葡萄病毒種類調(diào)查與檢測技術(shù)研究[J]. 中外葡萄與葡萄酒，2004（4）： 27-28.

[9] SAMBROOK J， FRITSCHE F， MANIATIS T. Molecular cloning： a laboratory manual [M]. 2nd. NY： Clod Spring Harbor Laboratory， 1989.

[10] ROYOJI N， MASAAKI N. Efficient methods for sample processing and cDNA synthesis byRT-PCR for the detection of grapevine viruses and viroids[J]. Journal of Virological Methods， 2006， 134： 244-249.

[11] JIANG Yu， WANG Jian-hui， YANG Hui， XU Mo-yun， YUAN Shu， SUN Wen， XU Wei-lin， XI De-hui， LIN Hong-hui. Identification and sequence analysis of turnip mosaic virus infection cruciferous crops in southwest of China[J]. Journal of Plant Pathology， 2010， 92： 241-244.

[12] FOISSAC X， SVANELLA-DULUCQ M J， CANDRESSE T， GENTIT P. Polyvalent detection of fruit tree tricho， capillo and foveaviruses by nested RT-PCR using degenerated and inosine containing primers （PDO RT-PCR）[J]. Acta Hort， 2000， 550（5）： 37-44.

[13] WANG Jian-hui， LIU Jian-jun， CHEN Ke-ling，LI Hong-wen， HE Jian， GUAN Bin. Studies on the transgenic strawberry mediated by agrobacterium[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences， 2012，25： 1011-1013.

王建輝，劉建軍，陳克玲，李洪雯，何建，關(guān)斌. 根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)草莓轉(zhuǎn)基因研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，25： 1011-1013.

[14] WANG Jian-hui， LIU Xiao， XI De-hui， YUAN Shu， JIANG Yu， YANG Hui， DU Jun-bo， ZHANG Zhong-wei， CHEN Ke-ling， LIN Hong-hui. Cloning and prokaryotic expression of CP gene of grapevine virus A Sichuan isolate[J]. Acta Horticulturae Sinica，2008， 35（7）： 967-972.

王建輝， 劉曉， 席德慧，袁澍， 蔣彧， 楊輝， 杜俊波， 張中偉， 陳克玲，林宏輝. 葡萄A病毒四川分離物的外殼蛋白基因克隆與原核表達(dá)[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2008，35（7）： 967-972.

[15] XU Z Y， HONG N， XING B， WANG G P. Partial molecular characterization of a Chinese isolate of grapevine leafroll-associated virus 2 and production of antisera to recombinant viral proteins[J]. Journal of Plant Pathology，2006， 88（1）： 89-94.

[16] BERTAZZON N， BORGO M， VANIN S，ANGELINI E. Genetic variability and pathological properties of Grapevine Leafroll-associated Virus 2 isolates [J]. Eur J Plant Pathol， 2010， 127： 185-197.

[17] WANG Jian-hui ，LIU Jian-jun，CHEN Ke-ling，LI Hong-wen，XI De-hui，LIN Hong-hui. Optimizing multiple detection and phylogenetic studies on grapevine leafroll associated virus-3 and grapevine virus A[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2011，38（12）： 2401-2410.

王建輝， 劉建軍， 陳克玲，李洪雯， 席德慧， 林宏輝. 葡萄卷葉伴隨3型病毒、葡萄A病毒多重檢測優(yōu)化研究與其系統(tǒng)進(jìn)化分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2011，38（12）： 2401-2410.

[18] REN Fang， FAN Xu-dong， DONG Ya-feng， ZHANG Zun-ping， WANG Jiao-min. Cloning and molecular variation analysis of coat protein gene of grapevine virus A[J]. Molecular Plant Breeding，2012， 10（5）： 568-574.

任芳，范旭東，董雅鳳，張尊平，王教敏. 葡萄A病毒外殼蛋白基因克隆及分子變異研究[J]. 分子植物育種，2012，10（5）： 568-574.

[19] WANG Z Q， HONG N， LIU Y， XU W X， WANG G P. Genetic variability and population structure of Grapevine virus A in China based on the analysis of the coat protein gene[J]. Canadian Journal of Plant Pathology，2011，33： 227-233.

[20] MUROLO S， ROMANZZI G， ROWHANI A， MINAFRA A， LA NOTTE P， BRANZANTI M B， SAVINO V. Genetic variability and population structure of Grapeivne virus A coat protein gene from naturally infected Italian vines[J]. European Journal Plant Pathology， 2007， 120： 137-145.