慢性乙型肝炎HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換與HBV 特異性細(xì)胞毒T 淋巴細(xì)胞、基因型的關(guān)系

吳寅濤，周玉麟 ，王學(xué)才

(1.宜興市人民醫(yī)院感染科，江蘇 宜興214200;2.宜興市人民醫(yī)院川埠分院感染科，江蘇 宜興214200)

在慢性乙型肝炎(CHB)患者抗病毒治療中，乙型肝炎病毒e 抗原(HBeAg)血清學(xué)轉(zhuǎn)換是評(píng)價(jià)抗病毒療效的重要標(biāo)志之一。國(guó)內(nèi)外研究顯示，影響HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換的因素有多方面，但關(guān)于阿德福韋酯治療CHB 患者后，HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換與乙型肝炎病毒(HBV)基因型、特異性細(xì)胞毒T 淋巴細(xì)胞(CTL)關(guān)系的相關(guān)研究并不多，本文通過觀察采用阿德福韋酯治療的80例CHB 患者，探討其HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換與外周血HBV 特異性CTL、HBV 基因型的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 臨床資料

收集2009年1月至2012年5月我院感染科CHB 患者80例，診斷符合2005年慢性乙型肝炎防治指南的標(biāo)準(zhǔn)。其中男44例，女36例，年齡22 ～59(33.91 ±9.02)歲，病程1 ～10年;HBeAg 陽(yáng)性50例(62.5%);所有患者均符合HBV DNA 陽(yáng)性(HBV DNA≥1 ×105拷貝/mL);肝功能異常，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)＞2 ×正常值上限;人白細(xì)胞抗原(HLA)-A2陽(yáng)性;均排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染;無(wú)自身免疫性疾病;無(wú)長(zhǎng)期大量飲酒史;無(wú)使用肝毒性藥物史;以前未使用核苷(酸)類似物和干擾素抗病毒治療或使用免疫調(diào)節(jié)藥物。

1.2 治療方法

患者服用阿德福韋酯(江蘇省連云港正大天晴藥業(yè)公司)10 mg，1 次/d，口服，療程12 個(gè)月。

1.3 檢測(cè)方法

HBVM 和HBV DNA:HBVM(HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe、抗HBc)應(yīng)用AusBio 全自動(dòng)酶免分析儀和上?？迫A公司試劑檢測(cè);HBV DNA:采用PCR 法，上海達(dá)安試劑檢測(cè)。肝功能:用Olympus AU2700 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

HLA-A2等位型的鑒定:取100 μL 肝素抗凝新鮮全血，加入檢測(cè)管和對(duì)照管，分別加入HLAA2-PE 及同型對(duì)照10 μL，室溫避光孵育30 min，經(jīng)溶血處理后用流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur)和美國(guó)BD 公司試劑檢測(cè)。HBV 特異性CTL:試管中加入10 μL 藻紅蛋白標(biāo)記的HLA-肽四聚體和CD8-異硫氰酸熒光素、CD3-PC5，再加入100 μL 的肝素抗凝血，同時(shí)做同型對(duì)照，混勻室溫避光孵育20 min，溶血洗滌后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以CD3+淋巴細(xì)胞設(shè)門計(jì)數(shù)50000 個(gè)CD8+細(xì)胞和HLA-肽四聚體雙陽(yáng)性細(xì)胞為特異性CD8+細(xì)胞，并以占總計(jì)數(shù)CD8+細(xì)胞的百分比表示，美國(guó)BD 公司試劑檢測(cè)。HBV 基因型:采用PCR 微板核酸雜交-ELISA技術(shù)，PE9600 型基因擴(kuò)增儀(美國(guó)PE 公司)，試劑為第一軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)診斷研究中心提供。引物及探針:選擇前C 區(qū)的不同序列作為PCR引物和核酸雜交探針，6 個(gè)基因型通用的序列作為PCR 的引物和通用包被探針，而同一部位的不同序列作為各型的顯色探針。顯色探針5＇標(biāo)記生物素，由上海生物工程公司合成。引物序列:引物1，5＇-CCCTTCTTCGTCTGCG-GTTCC-3＇(ntl490-1510)，引物2，5＇-ACCAATTTATGCCTACAGCCTC-3＇(ntl 798-1777)，按說明書操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(ˉ±s)表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換率

HBeAg 陽(yáng)性50例中發(fā)生HBeAg 轉(zhuǎn)陰14例(28%);HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換9例(18%)，無(wú)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換41例(82%)。

2.2 HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換率與HBV 基因型的關(guān)系

HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換9例中，B 基因型7例，占B基因型30.77%，C 基因型1例，占C 基因型4.17%;兩種基因型比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.32，P＜0.05)。

2.3 CHB 患者治療前與治療后12 個(gè)月肝功能、HBV DNA 和HBV 特異性CTL 水平比較

80例CHB 患者治療前與治療后12 個(gè)月肝功能、HBV DNA 和HBV 特異性CTL 水平比較，見表1。

表1 治療前與治療后12 個(gè)月患者肝功能、HBV DNA 和HBV 特異性CTL 水平比較±s

表1 治療前與治療后12 個(gè)月患者肝功能、HBV DNA 和HBV 特異性CTL 水平比較±s

組別 n 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶/U·L -1總膽紅素/μmol·L -1白蛋白/g·L -1 HBV DNA/log10拷貝·(mL)-1 HBV 特異性CTL/%治療前 80 253.49 ±119.91 19.61 ±10.21 41.44 ±3.21 6.25 ±0.70 0.34 ±0.10治療后 80 40.11 ±6.15 17.19 ±5.86 42.31 ±3.51 3.01 ±0.25 0.68 ±0.11 t 值 11.51 1.79 0.18 12.62 8.58 P 值＜0.01 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01

3 討論

目前研究認(rèn)為，乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制主要是機(jī)體清除HBV 而引發(fā)的細(xì)胞免疫病理改變;機(jī)體清除HBV 的細(xì)胞免疫機(jī)制可分為特異性與非特異性2種，其中特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答可能是機(jī)體清除病毒的重要途徑。HBV 特異性CTL 應(yīng)答在乙型肝炎發(fā)病機(jī)制中的作用日益受到重視，在未經(jīng)治療的慢性乙型肝炎患者體內(nèi)，往往存在T 細(xì)胞的低反應(yīng)［1]。本研究顯示，除能明顯降低CHB 患者ALT 及HBV DNA 外，阿德福韋酯還能提高CHB 患者的HBV 特異性CTL 功能，治療12 個(gè)月后HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換者與HBV 特異性CTL 水平升高可能有關(guān)，并可能與HBV 基因型有關(guān)。

國(guó)外研究認(rèn)為阿德福韋酯的抗病毒作用與HBV 基因型無(wú)關(guān)［2]，這主要是由于國(guó)外研究多關(guān)注基因A 型與D 型，觀察基因B 型與C 型較少，而我國(guó)患者感染以基因B 型與C 型為主［3]。曾愛中等［4]研究認(rèn)為，阿德福韋酯治療慢性乙型肝炎48 周時(shí)，部分病毒學(xué)指標(biāo)(如血清HBV DNA 下降均值和HBV DNA 陰轉(zhuǎn)率)B 基因型HBV 感染者優(yōu)于C 基因型。本研究發(fā)現(xiàn)，HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換者9例中，B基因型7例(占B 基因型30.77%)，C 基因型2例(占C 基因型4.17%)，B 基因型HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換明顯高于C 基因型。據(jù)此推斷，HBV 基因型(B型與C 型)可能是阿德福韋酯治療HBV 患者發(fā)生HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換的影響因素之一。

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［2]Westland C，Delaney WT，Yang H，et al. Hepatitis B virus genotypes and virologic response in 694 patients in phase Ⅲstudies of adefovirdipivoxil［J]. Gastroenterology，2003，125(1):107-116.

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［4]曾愛中，鄧惠，彭鳳英，等. B 和C 基因型乙型肝炎病毒對(duì)阿德福韋酯治療的病毒學(xué)應(yīng)答比較［J].中華肝臟病雜志，2008，16(6):412-415.