超細(xì)氯化鈉粉的BALB/C 小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn)

吳占敖，范利娟，許華君，端禮榮

(1.解放軍第359 醫(yī)院口腔科，江蘇 鎮(zhèn)江212001;2.解放軍第359 醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 鎮(zhèn)江212001;3.中國鹽業(yè)總公司鎮(zhèn)江鹽化公司，江蘇 鎮(zhèn)江212001;4.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013)

氣溶膠鹽療法是最近幾年從俄羅斯引進(jìn)的一種控微氣候物理治療方法，其特點(diǎn)是利用干燥NaCl微粒氣霧在仿鹽礦氣候的環(huán)境內(nèi)造成最佳的溫濕度條件，通過患者吸入而發(fā)揮其治療作用。目前，該法已作為一種治療哮喘、支氣管炎癥等呼吸道疾病的新型非藥物方法應(yīng)用于臨床。其中發(fā)揮治療作用的是5 ～8 μm 大小的干燥氯化鈉氣霧顆粒［1]。為保障人體用藥安全，需要確定超細(xì)氯化鈉粉的安全性。小鼠骨髓微核試驗(yàn)是藥品注冊(cè)技術(shù)規(guī)范國際協(xié)調(diào)會(huì)(International Conference on Harmonization，ICH)推薦的檢測(cè)致突變物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)，以小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞(polychromatic erythrocyte，PCE)中的微核數(shù)目作為評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)毒性的指標(biāo)，具有經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)［2-5]。本研究對(duì)BALB/c 小鼠連續(xù)予不同濃度的超細(xì)氯化鈉粉(pM 2.5-10)灌胃后，觀察小鼠骨髓細(xì)胞的毒性反應(yīng)，并通過計(jì)算骨髓細(xì)胞的微核率，對(duì)超細(xì)氯化鈉粉進(jìn)行安全毒理學(xué)評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

超細(xì)氯化鈉粉(pM2.5-10)為白色顆粒，溶于水，由江蘇省金壇鹽礦提供。環(huán)磷酰胺(CP)由上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn);姬姆薩染液為上海江萊生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 動(dòng)物

6 ～8 周齡BALB/c 小鼠，雌性，清潔級(jí)，體質(zhì)量18 ～20 g，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。自由攝水，室溫(24 ±2)℃，濕度45% ～65%，適應(yīng)性喂養(yǎng)3d 后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 小鼠急性毒性試驗(yàn)

小鼠50 只，在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，隨機(jī)分為3 個(gè)劑量組，超細(xì)氯化鈉粉劑量范圍為高、中、低(5.0、2.5、1.25 mg/kg)，另設(shè)正常對(duì)照組、陽性對(duì)照組，共5 組，每組10 只，試驗(yàn)前禁食6 h，其中3 個(gè)劑量組經(jīng)口灌服不同濃度的超細(xì)氯化鈉粉溶液，連續(xù)觀察14d，陽性對(duì)照組給予腹腔注射環(huán)磷酰胺(CP)40 mg/kg，正常對(duì)照組采用腹腔注射生理鹽水。記錄小鼠中毒表現(xiàn)及死亡情況。

1.4 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

選用體質(zhì)量18 ～20 g 雌性小鼠50 只，隨機(jī)分為5 組，每組10 只，超細(xì)氯化鈉粉劑量組(試驗(yàn)組)經(jīng)口灌服，給藥量分別為5.0、2.5、1.25 mg/kg，陽性對(duì)照組環(huán)磷酰胺的給藥量為40 mg/kg，采用腹腔注射，正常對(duì)照組采用腹腔注射生理鹽水。多次染毒，每天染毒1 次，連續(xù)5d，末次染毒后6 h 后用頸椎脫臼法處死小鼠，取股骨或取胸骨，擦凈血污，剔去肌肉，剪去每節(jié)骨骺，用小型彎止血鉗取骨髓涂片，固定，Giemsa 染色。在低倍顯微鏡下選擇細(xì)胞完整、分散均勻、著色適當(dāng)?shù)膮^(qū)域，用油鏡觀察，每張涂片計(jì)數(shù)約1000 個(gè)胞質(zhì)清晰完整的嗜多染紅細(xì)胞(PCE)的微核率，結(jié)果以千分率(‰)表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)處理

應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，微核率均以ˉ±s表示，采用單因素方差分析及χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠急性毒性及一般觀察試驗(yàn)

由表1 可知，小鼠經(jīng)口灌服不同劑量的超細(xì)氯化鈉粉后，5.0 mg/kg 組小鼠活動(dòng)稍減弱，部分小鼠出現(xiàn)食欲稍減低，體質(zhì)量在第2 天開始下降，但初始體質(zhì)量(g)與5 天體質(zhì)量(g)比較無明顯變化。2.5 mg/kg 組和1.25 mg/kg 組的體質(zhì)量均無變化，與對(duì)照組比較，各超細(xì)氯化鈉粉處理組體質(zhì)量均無明顯差異(P＞0.05)。各組均無小鼠死亡，小鼠生長良好。陽性對(duì)照組(CP)體質(zhì)量減輕明顯(P＜0.05)。

表1 各組小鼠體質(zhì)量的變化Tab 1 Changes of body weight in every group

2.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核率的變化

陽性對(duì)照組(CP)微核細(xì)胞率為(111.6 ±25.5)‰，超細(xì)氯化鈉粉5.0 mg/kg 組微核細(xì)胞率為(13.7 ±2.89)‰，2.5 mg/kg 組為(9.1 ±2.99)‰，1.25 mg/kg 組為(8.2 ±3.05)‰，而正常對(duì)照組微核細(xì)胞率為(5.9 ±1.66)‰。與正常對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺組微核率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.6，P＜0.001)。超細(xì)氯化鈉粉各劑量組間微核細(xì)胞數(shù)比較，差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。超細(xì)氯化鈉粉各組與正常對(duì)照組比較，差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說明超細(xì)氯化鈉粉對(duì)小鼠骨髓PCE 無致突變作用。見圖1。

圖1 各組小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核數(shù)(油鏡×400)Fig 1 Numbers of bone marrow micronucleus of mice

3 討論

無著絲粒的染色體片段或因紡錘體受損而丟失的整個(gè)染色體，在細(xì)胞分裂后期仍留在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)成為微核。這種情況的出現(xiàn)往往是受到染色體斷裂劑作用的結(jié)果［7]。微核試驗(yàn)是檢測(cè)染色體或有絲分裂器損傷的一種遺傳毒性試驗(yàn)方法。微核試驗(yàn)作為檢測(cè)染色體損傷最常用而有效的細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)方法之一，已被當(dāng)今多國和國際組織列為誘變?cè)囼?yàn)的常規(guī)方法，并將其規(guī)定為新藥、食品添加劑、農(nóng)藥、化妝品等毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)的必做試驗(yàn)［8]。近年來，鹽療的應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓展，一些知名的研究機(jī)構(gòu)已加入到鹽療技術(shù)的開發(fā)過程中。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果已顯示，天然礦鹽粉吸入療法能改善哮喘小鼠肺部炎癥［9]，本試驗(yàn)進(jìn)一步觀察超細(xì)NaCl 對(duì)小鼠的遺傳毒性，通過小鼠急性毒性、一般觀察試驗(yàn)及微核試驗(yàn)，未顯示超細(xì)氯化鈉粉對(duì)小鼠具有明顯毒性，特別是骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率未見明顯增加，表明在試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，超細(xì)氯化鈉粉無致突變性。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果為將鹽粉應(yīng)用于呼吸道疾病的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1]余璞，余健民.鹽霧療法的進(jìn)展［J]. 江西醫(yī)藥，2010，45 (10):1053-1055.

［2]傅鵬，張宗鵬. 新藥評(píng)價(jià)中遺傳毒性試驗(yàn)方法學(xué)研究及其發(fā)展趨勢(shì)［J]. 天津藥學(xué)，2004，16 (5):43-46.

［3]黃芳華. ICH 遺傳毒性標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合的最新要求［J].藥物評(píng)價(jià)研究，2009，32 (1):10-12.

［4]黃芳華. ICH 遺傳毒性結(jié)果評(píng)價(jià)和追加試驗(yàn)策略指導(dǎo)原則介紹［J]. 藥物評(píng)價(jià)研究，2009，32 (2):81-83.

［5]李宏. 微核實(shí)驗(yàn)的研究進(jìn)展［J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37 (7):2864-2866.

［6]王磊.聚肌胞毒理學(xué)和藥效學(xué)的初步研究［D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007:28-42.

［7]Dohil MA，Lin P，Lee J，et al.The epidemiology of molluscum contagiosum in chidren［J]. J Am Acad Dermatol，2006，54(1):47-54.

［8]Kirkland DJ，Henderson L，Marzin D，et al. Testing strategies in mutagenicity and genetic toxicology:an appraisal of the guidelines of the European Scientific Committee for Cosmetics and Non-Food Products for the evaluation of hairdyes［J].Mut Res，2005，588(2):88-105.

［9]范利娟，許華君，吳占敖，等.礦鹽粉粒吸入療法對(duì)哮喘小鼠肺組織病理形態(tài)及血清IL-4、IL-5、IL-13 水平的影響［J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2012，22(5):374-377.