胞內(nèi)高遷移率族蛋白B1 對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠心臟成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 表達(dá)的影響

潘皓，韓堯輝，張贏予，毛俊倩，周艷芳，王好，鮑永輝，趙龍，張國(guó)輝

(江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212002)

糖尿病導(dǎo)致的心血管疾病是糖尿病患者健康的主要威脅之一。糖尿病引起的代謝紊亂直接影響心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的功能，促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡、壞死，心肌間質(zhì)膠原的沉積，微血管病變，神經(jīng)病變等，導(dǎo)致心功能下降，即糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)［1]。DCM 的發(fā)病過(guò)程是多因素共同作用的結(jié)果［1]，主要包括高血糖，血脂異常，胰島素抵抗，氧自由基產(chǎn)物的增加，細(xì)胞內(nèi)鈣超載等。炎癥反應(yīng)是糖尿病引起的靶器官損害的病理生理變化中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。胞內(nèi)高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1，HMGB1)作為體內(nèi)一個(gè)多種急、慢性炎癥反應(yīng)的重要的炎癥介質(zhì)和炎癥調(diào)節(jié)分子，參與了高糖引起的炎癥反應(yīng)［2-3]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是一個(gè)多效性分子，廣泛參與了細(xì)胞的增殖、分化、生長(zhǎng)以及炎癥和細(xì)胞外基質(zhì)沉積的調(diào)節(jié)等多種活動(dòng)。在各種原因?qū)е碌男呐K重塑中TGF-β1通路是關(guān)鍵的信號(hào)通路之一［4]。本研究觀察高糖作用心臟成纖維細(xì)胞不同時(shí)間后HMGB1、TGF-β1 表達(dá)量的變化以及HMGB1 siRNA 對(duì)高糖誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞TGFβ1 表達(dá)量的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和主要試劑

健康的3 周齡C57/BL6 小鼠，雌雄不限，由江蘇大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。DMEM 低糖培養(yǎng)基、胰酶(美國(guó)Gibco 公司)，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)，波形蛋白(vimentin)抗體、鏈霉素親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(SABC)免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，轉(zhuǎn)染試劑RNAiMax、Trizol(美國(guó)Invitrogen 公司)，cDNA 第一鏈合成試劑盒、qPCR 擴(kuò)增試劑盒(加拿大Fermentas 公司)。其余生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 小鼠原代心臟成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng) 拉頸脫臼處死小鼠，75%乙醇浸泡消毒，無(wú)菌操作下取心臟，將心臟剪碎成1 mm3大小的碎塊，加入消化液(0.08%胰酶和1%Ⅰ型膠原酶1 ∶1 混合)于37℃水浴，每10 min 收集消化后的上清并用等體積的含20%血清的培養(yǎng)基中和，直至組織塊變透明消失，將收集的細(xì)胞離心重懸接種，4 h 后除去未貼壁的細(xì)胞，重新加入含10%血清的DMEM 低糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第2 天換液，以后每2 天換液1 次。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)傳代。5 代以后的細(xì)胞形態(tài)明顯改變，實(shí)驗(yàn)選擇2 ～4代細(xì)胞。高糖培養(yǎng)不同時(shí)間(0，6，12，24，48 h)后分別檢測(cè)HMGB1、TGF-β1 mRNA 的表達(dá)量。

1.2.2 心臟成纖維細(xì)胞的形態(tài)觀察和鑒定 顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞形態(tài)。取傳代后的心臟成纖維細(xì)胞嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明的免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行波形蛋白鑒定。

1.2.3 siRNA 轉(zhuǎn)染 siRNA 由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成，HMGB1 siRNA:上游序列5＇-CUCGUUAUGAAA GAGAAAUTT-3，下 游 序 列5＇-AUUUCUCUUUCAUAACGAGTT-3＇;陰性對(duì)照siRNA:上游序列5＇-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3＇，下游序列5＇-ACGUGA CACGUUCGGAGAATT-3＇。按照轉(zhuǎn)染試劑RNAiMax說(shuō)明操作，最終陰性對(duì)照siRNA 和HMGB1 siRNA 的濃度為60 nmol/L。siRNA 干擾24 h后換液。高糖培養(yǎng)6 h 后，分別檢測(cè)對(duì)照組和HMGB1 siRNA 組的HMGB1 和TGF-β1 mRNA 的表達(dá)量。

1.2.4 RT-PCR 檢測(cè)成纖維細(xì)胞HMGB1、TGF-β1 mRNA 的表達(dá) Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參。引物由上海生工合成，HMGB1 上游引 物:5＇-GGGTCACATGGATTATTAGTG-3＇，下 游引 物:5＇-CAGGGCATGTGGACAAAAG-3＇，產(chǎn) 物73 bp;TGF-β1 上 游 引 物:5＇-ACGCCTGAGTGGCTGTCTTTTGAC-3＇，下游引物:5＇-GGGCTGATCCCGTTGATTTCCACG-3＇，產(chǎn)物149 bp;β-肌動(dòng)蛋白上游引物:5＇-TGGAATCCTGTGGCATCCAGAAAC-3＇，下 游引物:5＇-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3＇，產(chǎn)物349 bp。按試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以cDNA 產(chǎn)物為模板進(jìn)行目的片段的PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件:95 ℃10 min，然后95 ℃15 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物的特異性通過(guò)熔解曲線分析確認(rèn)。反應(yīng)結(jié)束后，數(shù)據(jù)以2-ΔΔCT法表達(dá)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.00 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。兩組數(shù)據(jù)比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠心臟成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

原代培養(yǎng)60 min 后即有部分細(xì)胞貼壁，呈橢圓形或不規(guī)則形，4 h 后大量細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)1 ～2d后伸展為梭形或多角形，胞體較大，胞質(zhì)透明，?？梢?jiàn)2 ～3 個(gè)核，呈散在生長(zhǎng)。3 ～4d 后增殖明顯，開(kāi)始聚集生長(zhǎng)，呈漩渦狀或放射狀(圖1)。傳代后的細(xì)胞貼壁速度明顯加快。第5 代以后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。

2.2 細(xì)胞鑒定

培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞波形蛋白抗原免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽(yáng)性，胞質(zhì)呈棕黃色(圖2)。

2.3 高糖培養(yǎng)不同時(shí)間對(duì)心臟成纖維細(xì)胞HMGB1、TGF-β1 mRNA 表達(dá)的影響

高糖培養(yǎng)液處理6，12，24，48 h 心臟成纖維細(xì)胞的HMGB1 mRNA 表達(dá)量明顯上升(F=42. 18，P＜0.01)(圖3)，同時(shí)TGF-β1 mRNA 表達(dá)量也有增加(F=8.33，P＜0.01)(圖4)。其中在6 h，HMGB1、TGF-β1 mRNA 增加較明顯。

圖1 原代培養(yǎng)小鼠心臟成纖維細(xì)胞(×200)Fig 1 The cultured cardiac fibroblasts isolated from C57/BL6 mice(×200)

圖2 心臟成纖維細(xì)胞波形蛋白表達(dá)情況(免疫細(xì)胞化學(xué)染色×200)Fig 2 Vimentin presentation of cardiac fibroblasts(immunocytochemical staining×200)

圖3 心臟成纖維細(xì)胞高糖培養(yǎng)不同時(shí)間后HMGB1 mRNA 的表達(dá)Fig 3 The expression of HMGB1 mRNA of cardiac fibroblasts treated by high glucose fordifferent times

圖4 心臟成纖維細(xì)胞高糖培養(yǎng)不同時(shí)間后TGF-β1 mRNA 的表達(dá)Fig 4 The expression of TGF-β1 mRNA of cardiac fibroblasts treated by high glucose fordifferent times

2.4 HMGB1 siRNA 轉(zhuǎn)染后心臟成纖維細(xì)胞HMGB1、TGF-β1 mRNA 的表達(dá)

siRNA 組的HMGB1 mRNA 表達(dá)量較對(duì)照組明顯下降(t=5.40，P＜0.01)(圖5)，這說(shuō)明HMGB1 siRNA 的轉(zhuǎn)染是成功的。同時(shí)檢測(cè)到HMGB1 siRNA 明顯抑制了高糖培養(yǎng)6 h 后心臟成纖維細(xì)胞TGF-β1 mRNA 的表達(dá)(t= 2.55，P＜0.05)。見(jiàn)圖6。

圖5 HMGB1 siRNA 對(duì)高糖培養(yǎng)6 h 后心臟成纖維細(xì)胞表達(dá)HMGB1 mRNA 的影響Fig 5 The effect of HMGB1 siRNA on the expression of HMGB1 mRNA of cardiac fibroblasts treated by high glucose for 6 h

圖6 HMGB1 siRNA 對(duì)高糖培養(yǎng)6 h 后心臟成纖維細(xì)胞表達(dá)TGF-β1 mRNA 的影響Fig 6 The effect of HMGB1 siRNA on the expression of TGF-β1 mRNA of cardiac fibroblasts treated by high glucose for 6 h

3 討論

本研究對(duì)幼年小鼠心臟成纖維細(xì)胞的離體培養(yǎng)在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上做了一些改進(jìn)。首先，采用較低濃度的胰蛋白酶和較高濃度的Ⅰ型膠原酶混合的雙酶消化法，膠原酶的使用不僅減小了胰酶對(duì)細(xì)胞的損害而且有利于消化細(xì)胞間質(zhì)，提高細(xì)胞獲得率。其次，我們經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)每次消化10 min 較合適，消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)造成細(xì)胞不可逆的損害，過(guò)短消化不完全，細(xì)胞數(shù)量不足。再次，由于非新生鼠的心臟成纖維細(xì)胞貼壁時(shí)間較長(zhǎng)，并且利用酶消化法時(shí)非新生鼠的心肌細(xì)胞不貼壁，而成纖維細(xì)胞是優(yōu)勢(shì)細(xì)胞可以通過(guò)傳代純化，故我們延長(zhǎng)了差速貼壁的時(shí)間至4 h。最終結(jié)果表明，我們獲得了符合實(shí)驗(yàn)要求的細(xì)胞。

HMGB1 是與染色體結(jié)合的非組蛋白成分之一，可以被分泌至胞外，在胞內(nèi)胞外發(fā)揮多種生物學(xué)功能，并參與多種病理生理過(guò)程。在小鼠膿毒癥模型中［5]，HMGB1 的產(chǎn)生晚于TNF-α、IL-1 等炎癥介質(zhì)，且能反過(guò)來(lái)刺激TNF-α、IL-1、IL-6 等的釋放，誘發(fā)炎癥擴(kuò)大的正反饋效應(yīng)。根據(jù)Volz 等［3]的報(bào)道，高糖能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞HMGB1 表達(dá)增高，HMGB1 作為一個(gè)重要的炎癥介質(zhì)和炎癥調(diào)節(jié)因子可能是糖尿病引起炎癥反應(yīng)的一個(gè)新的分子機(jī)制。本研究結(jié)果亦表明高糖能夠促進(jìn)小鼠心臟成纖維細(xì)胞HMGB1 的表達(dá)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)高糖能夠促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞TGF-β1 的表達(dá)，與Tokudome 等［6]的研究結(jié)果一致。心肌纖維化在DCM 的發(fā)生發(fā)展中起著不可忽視的作用，TGF-β1能刺激成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化并促進(jìn)膠原的合成與分泌，能通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性和促進(jìn)金屬蛋白酶組織抑制劑的合成從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，能誘導(dǎo)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子等多種促纖維化相關(guān)因子的生成，故TGF-β1 可能在DCM 的發(fā)生發(fā)展中起著不可忽視的作用。

我們使用siRNA 干擾HMGB1 的表達(dá)，高糖處理6 h 后心臟成纖維細(xì)胞的HMGB1 的表達(dá)量下降，同時(shí)TGF-β1 的表達(dá)量也下降，這說(shuō)明HMGB1 可能影響高糖誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的TGF-β1 表達(dá)。HMGB1 分泌至胞外后與胞膜上的RAGE 結(jié)合，通過(guò)p38 MAPK、c-Jun N 端激酶(JNK)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1 和2(ERK1/2)等途徑活化下游的核因子κB(NF-κB)，促進(jìn)TNF-α、IL-1、IL-6 等多種細(xì)胞因子的釋放［7]。TNF-α 能夠刺激肺成纖維細(xì)胞TGF-β1 表達(dá)增高［8]，故對(duì)于高糖培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞，HMGB1 有可能通過(guò)TNF-α 促進(jìn)TGF-β1 的表達(dá)，這能在一定程度上解釋我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但確切的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上，心臟成纖維細(xì)胞在高糖培養(yǎng)下HMGB1、TGF-β1 表達(dá)增高，siRNA 干擾HMGB1 后TGF-β1表達(dá)下降，提示HMGB1 可能參與了高糖培養(yǎng)時(shí)心臟成纖維細(xì)胞表達(dá)TGF-β1 的調(diào)節(jié)，這可能是糖尿病時(shí)心臟纖維化的重要機(jī)制之一。因此針對(duì)HMGB1 的治療措施可能有助于抑制糖尿病心肌病的心臟纖維化。未來(lái)還需要進(jìn)一步研究在糖尿病動(dòng)物模型中是否也存在HMGB1 對(duì)TGF-β1 表達(dá)的影響。

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