SSR分子標(biāo)記技術(shù)在茄子雜交種子純度鑒定中的應(yīng)用

張敏 談太明 徐長城 談杰 黃樹蘋 王春麗

摘要：利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行種子純度鑒定是一種準(zhǔn)確快速、簡單高效的方法。試驗選用100對引物在鄂茄子2號親本間進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從中篩選出的3對引物SM17、SM29、SM51在雙親本間能夠擴(kuò)增出差異互補(bǔ)的條帶。利用這3對引物對鄂茄子2號雜種一代群體進(jìn)行純度鑒定，鑒定結(jié)果為97.1%；與同批次種子的田間鑒定結(jié)果（96.1%，鑒定地點(diǎn)海南島）接近，說明應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)實施茄子雜種一代種子的純度鑒定是可行的。

關(guān)鍵詞：茄子；SSR分子標(biāo)記技術(shù)；種子純度；鑒定

中圖分類號：S641.1；Q503；S339.3+1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）08-1959-04

種子純度鑒定是種子質(zhì)量保證的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響到作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。傳統(tǒng)的種子鑒定方法主要有種子形態(tài)鑒定法、幼苗鑒定法和田間小區(qū)種植鑒定法[1]，這些方法不僅需要較多的土地、勞力與財力，而且很容易受到環(huán)境因素的干擾，同時鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性往往不高[2，3]。簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）是近年來發(fā)展起來的一種DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）完成檢測，所需的DNA樣品量少，對DNA質(zhì)量要求也不高，加之SSR呈共顯性遺傳，可鑒別雜合子與純合子；并且多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、結(jié)果穩(wěn)定可靠[4-7]，因而受到普遍歡迎，應(yīng)用的農(nóng)作物種類不斷增加。SSR技術(shù)既有限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性技術(shù)（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）的穩(wěn)定性高和共顯性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)[6，8，9]，又比隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA標(biāo)記技術(shù)（Randomly amplifiled polymorphic DNA，RAPD）成本低、技術(shù)簡單[10]，所以在種子純度鑒定中的應(yīng)用非常廣泛，已在水稻（Oryza sativa L.）[11-13]、小麥（Triticum aestivum L.）[14-20]、玉米（Zea mays L.）[21-25]、棉花（Gossypium spp.）[26-31]、大豆[Glycine max（L.）Merr.][32-35]、油菜（Brassica napus L.）[36，37]、花生（Arachis hypogaea L）[5，38，39]、向日葵（Helianthus annuus L.）[40]、苜蓿（Medicago sativa L.）[41，42]、西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum. et Nakai.] [43]、甜瓜（Cucumis melo L.）[44]、黃瓜（C. sativus L.）[3，45]、大白菜[B. campestris L. ssp. pekinensis（Lour.）Olsson][46，47]、甘藍(lán)（B. oleracea L. var. capitata L.）[48]、辣椒（Capsicum annuum L.）[49]、 番茄（Solanum lycopersicum L.）[50]、馬鈴薯（S. tuberosum L.）[51]、蓮藕（Nelumbo nucifera Gaertn.）[52]等農(nóng)作物、蔬菜種子中都有報道。試驗通過從美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻(xiàn)報道中篩選合適的SSR引物，完成鄂茄子2號（Solanum melongena L. cv. E- Qiezi No.2）種子純度的鑒定，以期為準(zhǔn)確快速、簡單高效的茄子雜交種純度鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及處理 供試植物材料鄂茄子2號與其母本HLE-1、父本HLE-9均由武漢漢龍種苗有限責(zé)任公司提供，采用穴盤播種法育苗，在幼苗出現(xiàn)3～4片真葉時采集葉片，用液氮冷凍后放入冰箱（-70 ℃）內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 2×CTAB DNA提取緩沖液由2%CTAB、2%PVP、100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、25 mmol/L EDTA、2.0 mol/L NaCl組成；TE由10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA組成，用于DNA的溶解及保存，使用時添加RNase A 至終濃度為20 ng/mL；電泳緩沖液10×TBE由Tris 108 g、硼酸55 g、0.5 mol/L EDTA 40 mL加水至1 000 mL組成，工作濃度為0.5×TBE；Taq DNA聚合酶、dNTPs、分子量Marker為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；其他各種化學(xué)試劑如氯仿、異戊醇、AgNO3、異丙醇、乙醇、NaAc等均為國產(chǎn)分析純。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司提供，引物編號SM1-SM100。

1.1.3 儀器 主要有2720-PCR儀（美國ABI公司）、FR-980生物電泳圖像分析系統(tǒng)（上海復(fù)日科技有限公司）、DYY-6C型全自動三恒多用電泳儀（北京市六一儀器廠）、DYCZ-28C垂直電泳槽（北京市六一儀器廠）、SPECORD200型紫外-可見光分光光度計（德國耶拿分析儀器股份公司）、GL21R高速冷凍離心機(jī)（上海知正離心機(jī)有限公司）、HH-8B數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠）、SW-CJ-1A 超凈工作臺（江蘇省吳江市隆聚凈化科技有限公司）、DHG-9420A-電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠）等。

1.2 方法

1.2.1 茄子葉片DNA的提取 采用CTAB法[53]，隨機(jī)選取鄂茄子2號F1幼苗150株，父本HLE-9、母本HLE-1各1株；每份材料取0.2 g葉片樣，剪碎后放入2 mL EP管內(nèi)（100 μL 的2×CTAB 加鋼珠1顆）；在磨樣器上將葉片打碎，加入700 μL的 2×CTAB混勻；65 ℃ 水浴1 h，每10 min上、下輕微顛倒一次；加入800 μL氯仿-異戊醇（24∶1，體積比，下同）混勻后于4 ℃、10 000 r/min離心10 min；取上清液于新的EP管中，再加入等體積的氯仿-異戊醇抽提一次；復(fù)取上清液于新的EP管中，加入等體積的異丙醇（約500 μL，-20 °C預(yù)冷）和1/10體積的3 mmol NaAc（約50 μL），混勻后于-20 ℃沉淀1 h；4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清液，收集沉淀并風(fēng)干；用700 μL 75%的乙醇洗滌沉淀2次，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清；加入200 μL TE（pH 8.0）溶解沉淀DNA，并加入1 μL 10 mg/mL RNaseA于37 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中放置1 h，以去除殘留的RNA；用紫外-可見光分光光度計檢測DNA濃度，將提取的DNA濃度調(diào)至100 ng/μL，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR引物的篩選 ①從NCBI數(shù)據(jù)庫中挑選多態(tài)性較高的SSR引物100對[54]。②將引物用滅菌的去離子水溶解至 10 μmol。③PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系15 μL，包含1.50 μL 10×PCR Buffer、0.30 μL dNTPs（10 mmol）、0.25 μL Primer F（10 μmol）、0.25 μL Primer R（10 μmol）、0.20 μL Taq DNA聚合酶（相當(dāng)于2.5 U/μL）、11.50 μL去離子水、1 μL DNA（100 ng/μL）。④PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性40 s，設(shè)置溫度梯度52～60 ℃，退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。⑤PCR反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠預(yù)檢測其擴(kuò)增效果，并確定每對引物的最適退火溫度。⑥調(diào)整好最適退火溫度，分別以鄂茄子2號的父本、母本DNA為模板再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，找出能區(qū)分父本和母本的特異性引物。

1.2.3 F1代種子純度檢測 用篩選確定的特異引物進(jìn)行鄂茄子2號F1群體檢測（反應(yīng)體系和條件同上）；將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物先用瓊脂糖凝膠預(yù)檢測，以確定PCR擴(kuò)增是否成功；然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，AgNO3染色后拍照。

1.2.4 田間種植純度鑒定 2011年秋季在海南島試驗基地采用營養(yǎng)缽播種，幼苗5～6片真葉時定植，行株距60 cm×50 cm，鄂茄子2號定植110株，其雙親各定植10株，常規(guī)栽培管理。在植株對茄期通過植株和果實特性的調(diào)查來比較各方差異，從而進(jìn)行鄂茄子2號的純度鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異引物的篩選

用100對SSR引物對鄂茄子2號的雙親進(jìn)行引物篩選，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見圖1。由圖1可見，篩選到的引物SM17、SM29、SM51擴(kuò)增帶在父本和母本間出現(xiàn)互補(bǔ)條帶，3對引物序列如下：

SM17——F鏈5′-ATCAATGACACCCAAAACC

CATTT-3′；R鏈5′-GTTTGAAAACCCAATACAAAT

CCGA-3′。SM29——F鏈5′-ATTGTGTCGATGAG

ATTTTGGTCA-3′；R鏈5′ GTTTAGCTACGTTGGTT

TGGTGCTGAA-3′。SM51——F鏈5′-AGTCCACCA

TGAGTGAGTGAGTGA-3′；R鏈5′-GTTTACGTGTT

GGGCCTCCAAAATATC-3′。

這個結(jié)果說明3對引物可以區(qū)分父本和母本，因而可用于鄂茄子2號種子純度的檢測。

2.2 F1種子純度的檢測

提取鄂茄子2號的F1樣品DNA，經(jīng)檢測最終獲得140份可用樣品。用上述3對引物分別進(jìn)行樣品PCR擴(kuò)增檢測，其中引物SM17和SM29純度鑒定結(jié)果一致，因此選用引物SM17進(jìn)行鄂茄子2號的純度檢測，結(jié)果見圖2。試驗在140份樣品中出現(xiàn)了4個同父本的單條帶，說明這4株為雜株，剩下的為純合F1代，因此被鑒定的鄂茄子2號種子純度為97.1%。

2.3 田間純度鑒定

在海南島試驗基地種植的鄂茄子2號最后存活植株103株，當(dāng)茄果達(dá)到正常商品果時統(tǒng)一進(jìn)行性狀調(diào)查，通過比較株型、葉型、果型、果色、萼片色等表型性狀對群體進(jìn)行純度鑒定，經(jīng)檢測確定雜株4株，因此計算其純度檢測結(jié)果為96.1%，這與SSR技術(shù)檢測的結(jié)果接近，說明SSR技術(shù)能夠用于茄子F1代種子純度的快速檢測。

3 討論

試驗利用SSR技術(shù)實施鄂茄子2號種子純度的鑒定，結(jié)果與田間鑒定結(jié)果保持了較好的一致性，說明利用SSR技術(shù)替代田間種植觀察完成茄子種子純度的快速檢測是可行的，有望克服田間調(diào)查周期長、受環(huán)境因素干擾較大等問題。

試驗在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載了100對SSR引物，但從中僅篩選出了3對有用的引物，其利用率相當(dāng)?shù)停欢谕N作物、不同品種間由于親緣關(guān)系較近，SSR表現(xiàn)出來的多態(tài)性都較差，因此在種子純度鑒定中SSR引物篩選的難度還是比較大的。同時，此技術(shù)前期開發(fā)新的SSR引物費(fèi)時耗力，并且成本高，使得SSR技術(shù)在實際運(yùn)用中受到了一定的限制。不過隨著NCBI數(shù)據(jù)庫的不斷擴(kuò)大和研究者的不斷挖掘，更多的SSR位點(diǎn)將被標(biāo)記出來，進(jìn)而開發(fā)成本也會降低。所以有理由相信SSR技術(shù)在種子純度鑒定方面的應(yīng)用前景廣闊。

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