低密度脂蛋白測定方法的進(jìn)展

王敬芳

摘要：血清或血漿中低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）與冠心病（CDH）發(fā)生和動脈粥樣硬化損傷呈正相關(guān)，而且是美國國家膽固醇教育計劃（NCEP）作為脂類疾病分類和風(fēng)險預(yù)測的一個重要指標(biāo)。LDL-C也是選擇藥物治療和預(yù)后方面的一個十分有意義的臨床指標(biāo)，國內(nèi)外都在研究和開發(fā)行之有效、可靠的標(biāo)準(zhǔn)化測定方法。本文對其有關(guān)的測定方法和研究進(jìn)展作綜述。

關(guān)鍵詞：低密度脂蛋白膽固醇 方法學(xué) 心血管疾病

臨床和流行病學(xué)研究證明血清中LDL-C與冠狀動脈粥樣硬化有密切的正相關(guān)[1]。在1986年病理學(xué)家們就研究證明LDL-C濃度越高時動脈粥樣硬化損傷的程度越大，粥樣硬化程度小時，測到血清中LDL-C也低[2，3]。

LDL是一組不均一的脂蛋白顆粒，一般認(rèn)為LDL的漂浮密度為1.006～1.063，且包括了中間密度脂蛋白（LDL）1.006～1.019及Lp（a）1.050～1.080。LDL中蛋白含量約為20%～25%，主要是載脂蛋白B-100（ApoB-100），而載脂蛋白E（ApoE）和載脂蛋白CⅡ（ApoCⅡ）含量很少。膽固醇的含量約是血清中總量的三分之二。LDL是通過受體途徑進(jìn)行降解，如過量時可以導(dǎo)致巨噬細(xì)胞和其他吞噬細(xì)胞變成泡沫細(xì)胞，這被認(rèn)為是與動脈粥樣硬化有關(guān)的因素。因此，LDL-C的測定結(jié)果直接影響到分類和治療。美國的NCEP專家組以LDL-C濃度將成人、小孩、青少年各分為：成人在3.37mmol/L（1300mg/L）以下為合適水平，在3.37～4.12mmol/L（1300～1590mg/L）間作為中危水平，高于4.14mmol/L（1600mg/L）時作為高危水平；小孩和青少年在2.85mmol/L（1100mg/L）以下為合適水平，在2.85～3.34 mmol/L（1100-1290mg/L）為中危水平，高于3.37mmol/L （1300mg/L）為高危水平[4]。為提高LDL-C測檢水平，國內(nèi)外對LDL-C測定方法進(jìn)行廣泛的研究并不斷改善，現(xiàn)將有關(guān)方法研究進(jìn)展綜述如下：

1、等密度和密度梯度超速離心法

血清中的各種脂蛋白的分離是LDL-C測定的一個重要環(huán)節(jié)。由于各種脂蛋白的大小、密度和組成及功能都有很大的不同。超速離心技術(shù)就是利用脂蛋白各種成分的密度不同將它們分離，是脂蛋白分離的主要方法。

1950年Delalla和Gofman首次報道等密度超速離心法。在實驗室中一般采用βQuantification（βQ）法，它利用1.006的臨界分離液，在離心力為10900g時離心18h，將血漿分成上下兩部分，上清液為VLDL和乳糜顆粒，下面為IDL、LDL和HDL。用試管切開技術(shù)將上下液體分開。下面部分再采用化學(xué)沉淀法將HDL和LDL及IDL分開，分別用酶法測定膽固醇。這方法已被臨床實驗室作為參考方法。而且還可以根據(jù)需要改變分離液密度，當(dāng)密度提高為1.019，可以將IDL與LDL和HDL分開，也可提高到1.21，分離出HDL等。但在選擇脂蛋白分離切點系指它們與緩沖液混和物的密度，而不是脂蛋白自身的密度。

另外有報道用密度梯度超速離心法。這種方法是將血清加入到已有不同密度梯度的分離液中，進(jìn)行超速離心后，血清中脂蛋白的各種成份可以轉(zhuǎn)移到各自相等密度的相等的區(qū)域。這種方法可以一次將脂蛋白中的各種成份分離。而不足之處是要求離心時間很嚴(yán)格，分開各種組份較困難。根據(jù)離心轉(zhuǎn)子的不同，可以分為水平轉(zhuǎn)子，垂直轉(zhuǎn)子以及固定角度轉(zhuǎn)子。水平轉(zhuǎn)子在實驗中已被證明分離效果最好，但要求離心時間長（17～66h）；垂直轉(zhuǎn)子可以縮短時間（45min～3h），由于轉(zhuǎn)動距離小，會有微量丟失；在等密度超速離心中首選固定角度轉(zhuǎn)子，如在密度梯度超速離心中使用時，離心時間要比垂直轉(zhuǎn)子稍長。

這兩種方法對實驗室要求條件高，一般實驗室都難以應(yīng)用。雖然現(xiàn)在有很多改良方法，克服了傳統(tǒng)方法的部分缺點，但分離的效果仍不能同傳統(tǒng)方法比。所有的超速離心法都有它們的局限性，它們所測得的結(jié)果仍是NCEP作為分類和治療的指標(biāo)。

2、譜法

根據(jù)脂蛋白分子的大小和親和性有很大的不同，利用層析技術(shù)對脂蛋白進(jìn)行分離。目前有多種色譜儀和分離柱被用于脂蛋白的分離。而瓊脂糖層析技術(shù)和Toya soda的高壓凝膠層析技術(shù)使用最普遍。這種方法是非破壞性，可以回收各種成份，有報道[6]LDL-C的回收率可以達(dá)到80%～98%，但穩(wěn)定性較差。目前這種技術(shù)也在不斷完善，但要求實驗條件高，操作繁瑣，時間長，儀器昂貴，難以在臨床實驗室應(yīng)用。

3、電泳

電泳技術(shù)是基于脂蛋白分子所帶的電荷和分子量大小不同進(jìn)行分離，早期這種技術(shù)在臨床實驗室普遍用于定性分析，直接觀察血清脂蛋白譜?，F(xiàn)在已不再推廣使用，大量實驗證明電泳電量法所得的結(jié)果不能令人滿意，并且發(fā)現(xiàn)與常規(guī)實驗測得的結(jié)果有誤差。有報道[7] 肝硬化膽道阻塞病人的血清脂蛋白譜顯示正常，而血清膽固醇濃度追憶忼于25.9mmol/L（10g/L）。因此還應(yīng)進(jìn)行總膽固醇（TC）測定。因為親脂性染料不能和游離膽固醇以及磷脂結(jié)合。另外，可以與超速離心法和化學(xué)沉淀法聯(lián)合使用，經(jīng)分離后，進(jìn)行某一組份純度分析。免疫與電泳技術(shù)結(jié)合，可以大大提高準(zhǔn)確度；以及全自動電泳分析儀出現(xiàn)，在常規(guī)實驗室進(jìn)行脂蛋白定量分析將成為可能。

4、化學(xué)沉淀法

肝素沉淀法。肝素在pH值5.12檸檬酸緩沖液中可以沉淀LDL，使LDL與其它脂蛋白分離，然后進(jìn)行膽固醇測定。這種方法pH值很重要。pH值必須使LDL顆粒的脂蛋白所帶電荷剛為正值。由于VLDL和LDL等電點分別為4.7和5.4，pH值5.12±0.02時LDL剛好可以完全沉淀，而VLDL不沉淀。肝素沉淀法與定量電泳法有很好的一致性，但當(dāng)TG含量大于4.58mmol/L（4000mg/L）時，一致性相對降低。在Ⅲ型血漿脂蛋白增高癥的病人血清中加沉淀劑時VLDL和Lp（a）與LDL發(fā)生共同沉淀，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差。這種方法在TG低時，它有很好的精密度，變異系數(shù)小于3.5%。與等密度超速離心法比較，當(dāng)TG濃度大于2.0mmol/L（1750mg/L）時，肝素法出現(xiàn)結(jié)果偏離[4]。近年Armstrong等[8]實驗證明降低pH值到4.85時Lp（a）沉淀。