原創(chuàng)中藥新藥紅珠膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究*

彭 維，蘇薇薇，古淑儀，王永剛，郭 靜

(1.中山大學(xué)廣州現(xiàn)代中藥質(zhì)量研究開發(fā)中心，廣東 廣州 510275；2. 廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山 528303)

紅珠膠囊是中山大學(xué)研制的原創(chuàng)中藥五類新藥，具有止咳、化痰的功效，用于呼吸道疾病引起的咳嗽，痰多。藥理研究表明：總黃酮類化合物是化橘紅發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[1-2]，其中柚皮苷為其主要的活性成分，占有效部位的70%以上。為保證產(chǎn)品質(zhì)量，確保臨床療效，本研究建立了制劑中柚皮苷、野漆樹苷的薄層色譜鑒別，并采用紫外分光光度法測定紅珠膠囊中總黃酮含量并進行溶出度考察，采用高效液相色譜法測定其中柚皮苷含量。

1 儀器與材料

Dionex P680型高效液相色譜儀(美國戴安公司，四元梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、PDA-100檢測器及Chromeleon工作站)； BP211D電子分析天平(瑞士沙多利斯公司)；ATS4薄層自動點樣儀，REPROSTAR 3薄層成像系統(tǒng)，TLC PLATE HEATERⅢ薄層板加熱器(瑞士CAMAG公司)；TU-1901紫外-可見光分光光度儀(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；ZRS-8G智能溶出試驗儀(天津大學(xué)無線電廠)；T660/H超聲波清洗器(美國埃瑪公司)。

化橘紅對照藥材(中國藥品生物制品檢定所提供，批號1165-200001)；柚皮苷(供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所提供，批號110722-200309)；野漆樹苷(美國Sigma公司提供，純度>95%，批號A8906)。6批紅珠膠囊由中山大學(xué)廣州現(xiàn)代中藥質(zhì)量研究開發(fā)中心研制，委托廣東環(huán)球制藥有限公司生產(chǎn)。

甲醇(德國默克)為色譜純，冰醋酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

取本品內(nèi)容物研磨均勻，取約0.2 g，加甲醇10 mL，超聲處理(功率360 W，頻率35 kHz)10 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取柚皮苷對照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg的溶液，作為對照品溶液。再取化橘紅對照藥材粉末1 g，加甲醇10 mL，超聲處理(功率360 W，頻率35 kHz)10 min，濾過，作為對照藥材溶液。吸取上述對照品溶液3 μL，對照藥材溶液、供試品溶液各1 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以丙酮-乙酸乙酯-水-冰醋酸(20∶40∶4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，60 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材、對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾，結(jié)果見圖1。

圖1 化橘紅對照藥材(1)、對照品(2)、陰性對照(3)、紅珠膠囊供試品(4-6)薄層色譜圖Fig.1 TLC of Citrus grandi reference drug(1)，CRS(2) negative control(3) and Hongzhu Capsule(4-6)

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 取已干燥至恒質(zhì)量的柚皮苷對照品15.00 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每 1 mL中含柚皮苷300 μg的對照品溶液Ⅰ；精密量取對照品溶液Ⅰ5 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL中含柚皮苷15 μg的對照品溶液Ⅱ。

2.2.2 供試品溶液的制備 取裝量差異項下的膠囊內(nèi)容物，研細，取0.1 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇約70 mL，超聲處理(功率360 W，頻率35 kHz)30 min，放冷至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液Ⅰ， 精密量取供試品溶液Ⅰ1 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液Ⅱ。

2.2.3 專屬性試驗 分別取上述對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液，以甲醇作為溶劑空白，分別進行光譜掃描(400～200 nm)，結(jié)果表明：對照品溶液和供試品溶液的光譜圖基本一致，最大吸收波長均在(283±1) nm，陰性對照溶液在283 nm處無干擾。故測定波長選擇283 nm。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取上述對照品溶液Ⅰ：0.00(空白)、0.10、0.30、0.50、0.70、0.90 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成對照品系列溶液。以甲醇作為空白，在波長283 nm測定吸收值。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸收度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為：A= 0.037 0C+0.012 6 (r=0.999 8)。柚皮苷質(zhì)量濃度在0～27 μg /mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗 取對照品溶液Ⅱ，連續(xù)測定6次，計算柚皮苷吸光度的RSD為0.41%，表明方法精密度好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液Ⅱ，分別于0、10、30、60、90、120 min測定，RSD為1.26%，表明供試品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取同一批號(20050102) 的紅珠膠囊內(nèi)容物粉末(以平均裝量0.120 10 g計)，研細，平行取樣6份，按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液6份，測定總黃酮的含量及計算RSD為2.45%，表明方法重復(fù)性較好。

2.2.8 加樣回收率試驗 按照高、中、低3個質(zhì)量濃度梯度，精密稱取已測知含量的紅珠膠囊(20050102，平均含量46.20 mg/粒，折算質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38.47%)樣品9份，每個質(zhì)量濃度梯度平行操作3份，再分別精密加入一定量的柚皮苷，依法測定，計算回收率，平均加樣回收率為99.63%(n=9)，RSD為1.95%。表明方法回收率好。

2.2.9 樣品測定 取上述對照品溶液Ⅱ及供試品溶液Ⅱ，在283 nm的波長處測定吸光度，計算，即得。

表1 紅珠膠囊總黃酮含量測定結(jié)果

本品每粒含總黃酮以柚皮苷(C27H32O14)計，不得少于38 mg，不得高于56 mg。

2.2.10 溶出度測定[3]取本品，每批隨機取6粒，照溶出度測定法(《中國藥典》2010年版二部附錄X C第一法)，以水900 mL為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100 r/min，依法操作，經(jīng)45 min，取溶液5 mL，濾過，精密量取續(xù)濾液2.5 mL，置5 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，按照上述總黃酮紫外分光光度法，在283 nm的波長處分別測定吸光度；另取柚皮苷對照品適量，精密稱定，加溶出介質(zhì)溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含16 μg的溶液，同法測定，計算每粒的溶出量及以實際含量計的溶出度，并作均一性比較。限度為實際含量的70%，應(yīng)符合規(guī)定。結(jié)果見表2。

表2 紅珠膠囊溶出度測定結(jié)果

2.3 柚皮苷的含量測定

2.3.1 色譜條件 Dikma Diamasil C18(4.6 mm×250 mm， 5 μm)；流動相：甲醇-醋酸-水(35∶4∶61)；檢測波長為283 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量5 μL。

2.3.2 專屬性試驗 分別量取對照品溶液Ⅰ、供試品溶液Ⅰ注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果柚皮苷能與樣品中其他成分峰分離良好。理論板數(shù)按柚皮苷峰計算應(yīng)不低于2 000，柚皮苷與鄰近色譜峰達到基線分離，分離度大于1.5。色譜圖見圖 2。

圖 2 柚皮苷對照品(A)和供試品(B)色譜圖Fig.2 HPLC of naringin CRS(A) and Hongzhu Capsule(B)

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密稱取柚皮苷對照品0.010 06 g，用甲醇定容到50 mL量瓶中，再精密吸取5 mL稀釋至10 mL，質(zhì)量濃度為0.100 6 mg/mL。按上述色譜條件，吸取柚皮苷對照品，以2、5、10、15、20 μL連續(xù)進樣，測定。以峰面積積分值A(chǔ)對對照品的進樣量C(μg)進行回歸分析，得回歸方程：柚皮苷A=27.907C-0.096 1，r=1.000 0。結(jié)果表明柚皮苷在0.201 2～2.012 0 μg范圍線性關(guān)系良好。

2.3.4 精密度試驗 精密吸取柚皮苷對照品溶液10 μL，在以上色譜條件下，連續(xù)重復(fù)進樣5次，依法測定，計算柚皮苷峰面積的RSD為1.03%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，室溫下分別放置0、2、4、8、12、24、48 h后，按“2.3.1”項色譜條件，取5 μL進樣，依法操作，測定峰面積，計算柚皮苷峰面積的RSD為2.14%，表明穩(wěn)定性較好。

2.3.6 重復(fù)性試驗 取同一批號的同一批號紅珠膠囊內(nèi)容物(批號20041222，平均裝量0.121 11 g) 6份，精密稱定，照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項色譜條件，進樣5 μL，測定柚皮苷的含量及計算RSD為1.95%，表明方法重復(fù)性較好。

2.3.7 加樣回收率試驗 精密稱取已測知柚皮苷含量的紅珠膠囊內(nèi)容物(批號20041222，柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)36.67%，44.42 mg/粒)適量，再分別精密加入一定量的對照品，使供試品溶液中的柚皮苷質(zhì)量濃度分別在柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的高、中、低區(qū)域各3份，照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項色譜條件，進樣5 μL，測定，計算，平均加樣回收率為97.92%，RSD為2.80%，表明方法回收率好。

2.3.8 樣品測定 取裝量差異項下的膠囊內(nèi)容物, 研細，精密稱定，照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取柚皮苷對照品、供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算樣品中柚皮苷的含量，結(jié)果見表3。

表3 紅珠膠囊中柚皮苷的含量測定結(jié)果

3 討 論

1)建立與國際接軌的中藥質(zhì)量控制方法，是中藥現(xiàn)代化的客觀要求[4-5]。紅珠膠囊的化學(xué)成分組成是以柚皮素為母核的柚皮苷、新北美圣草苷等二氫黃酮類化合物以及柚皮苷的氧化物野漆樹苷，最大吸收波長大多在(283±1) nm處，且柚皮苷含量占有效部位的70%以上，故可采用紫外分光光度法測定總黃酮含量。所建立的總黃酮含量測定方法可用于膠囊溶出度的測定。

2)本研究建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，方法簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，為全面監(jiān)控紅珠膠囊的質(zhì)量提供了可靠的方法。

參考文獻：

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[3] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典 (一部、二部)[S]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：69, 附錄85.

[4] 關(guān)倩怡，黃琳，彭維，等. 口炎清顆粒指紋圖譜研究[J].中山大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2011，50(1):115-118.

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