不同品種藍(lán)莓酒抗氧化能力及其多酚含量分析

梁 晨，張倩雯，盛啟明，潘 梟，游義琳，戰(zhàn)吉宬*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

藍(lán)莓（Blueberry）為杜鵲花科（Ericaceae）越桔亞科越桔屬（Vacciniumspp.）植物，為常綠或落葉灌木型果樹，廣泛分布于北半球[1-2]。其果實(shí)除含有豐富的糖、氨基酸、有機(jī)酸、維生素和礦物質(zhì)外，還富含原花青素、花色苷等多種多酚類生理活性成分，使藍(lán)莓果實(shí)具有很強(qiáng)的抗氧化性，具有減肥、促進(jìn)視紅素再合成、改善糖尿病并發(fā)癥、抗炎癥、增強(qiáng)心臟功能、抗心血管疾病、抗衰老、抗癌及抗突變等多種生理活性功能[3-10]。由于藍(lán)莓具備這些健康功效，因而被美國藍(lán)莓協(xié)會(huì)稱為繼蘋果和柑桔之后的“世界第三代水果”[11]。

藍(lán)莓由于富含原花青素等多種多酚類成分而成為保健品市場的新寵，隨著人們對健康生活的需求，藍(lán)莓的生產(chǎn)和加工引起了生產(chǎn)者和消費(fèi)者的廣泛關(guān)注[1，5]。目前，世界各國以藍(lán)莓果實(shí)為原料開發(fā)的加工產(chǎn)品種類繁多，主要作為糕點(diǎn)、糖果、酸奶、果凍、冰淇淋、餡餅等產(chǎn)品的配料，此外還加工成罐頭、果醬、果粉（晶）、蜜餞、速凍果、藍(lán)莓果酒、濃縮果汁、果汁飲料及深加工產(chǎn)品提取物等[11]。在眾多的藍(lán)莓加工產(chǎn)品中，藍(lán)莓酒既保留藍(lán)莓果實(shí)的營養(yǎng)價(jià)值，提高附加值，又為人們提供了一種天然保健、美容養(yǎng)顏的時(shí)尚飲品，滿足市場的需要。隨著我國飲料業(yè)的快速發(fā)展和人們保健意識(shí)的不斷加強(qiáng)，藍(lán)莓果酒等深加工產(chǎn)品將逐漸成為主導(dǎo)產(chǎn)品。

由于藍(lán)莓酒中含有花色苷、原花青素等豐富的多酚物質(zhì)，而使其具有很強(qiáng)的抗氧化能力，進(jìn)而在體內(nèi)具有多種生理活性功能，因此本文對6種不同品種和產(chǎn)地的藍(lán)莓酒的抗氧化能力及其總酚、總類黃酮、原花青素和總花色苷含量進(jìn)行了檢測分析，以科學(xué)評價(jià)藍(lán)莓酒的抗氧化功能，為深入開發(fā)利用藍(lán)莓資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究以4個(gè)產(chǎn)地共6種藍(lán)莓果實(shí)為原料，采用商業(yè)酵母RED FRUIT于本實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵，為干酒的工藝，共釀造藍(lán)莓酒6種，以此為試驗(yàn)材料，具體信息見表1。

二甲基亞砜（DMSO）、Trolox、0.05μm氧化鋁粉末、福林肖卡試劑、沒食子酸、兒茶素、蘆丁、甲醇等為色譜純試劑，購自于美國Sigma公司。

表1 6種藍(lán)莓酒信息Table 1 Information of six different blueberry wines

抗壞血酸、磷酸二氫鉀、正磷酸、硼酸、碳酸鈉、亞硝酸鈉、氯化鋁、氫氧化鈉、香草醛、氯化鉀、三水合乙酸鈉、乙酸、鹽酸、檸檬酸等均為分析純，購自于北京化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；pH 211 臺(tái)式pH 測定儀：北京億賽得科技發(fā)展有限責(zé)任公司；HWS24型電子恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；CHI620c電化學(xué)分析儀：上海辰華儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)莓酒抗氧化能力測定

參照文獻(xiàn)[12]的方法，采用循環(huán)伏安法，利用惰性碳電極響應(yīng)，根據(jù)清除自由基時(shí)提供電子的原理，評價(jià)不同物質(zhì)給電子的能力，進(jìn)而反映藍(lán)莓酒抗氧化活性的強(qiáng)弱。

伯瑞坦-羅賓森（Britton-Robinson，B-R）電解質(zhì)緩沖溶液：將0.271mL正磷酸溶液、0.236mL冰醋酸及0.247g硼酸，用純凈水溶解，調(diào)節(jié)pH值至3.0，定容至100mL。

樣品測量溶液：取適量藍(lán)莓酒，并用B-R緩沖液稀釋至合適濃度，加入0.2mol/L的支持電解質(zhì)KCl，使最終溶液體積為11mL。

奎諾二甲基丙烯酸酯（Trolox）標(biāo)準(zhǔn)溶液：取適量的Trolox用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，然后溶解于pH值為3.0的B-R緩沖液中，加入0.2mol/L的支持電解質(zhì)KCl溶液，使最終溶液體積為11mL，配成濃度分別為40μmol/L、80μmol/L、100μmol/L、120μmol/L、160μmol/L、200μmol/L。

采用三電極體系，鉑電極（對電極），Ag/AgCl 電極（參比電極）和玻璃電極（工作電極）。掃描速率是500mV/s，靈敏度是10μA/V，由-0.4V～+1.2V進(jìn)行掃描，通過參比電極的掃描，掃描段數(shù)2W，采樣間隔0.001V，靜置時(shí)間2s。將三電極體系插入混勻的待測溶液中，連接電源，采用循環(huán)伏安法對樣品進(jìn)行掃描分析。用不含樣品pH值為3.0的B-R 緩沖液做空白樣液，計(jì)算峰面積時(shí)樣品響應(yīng)結(jié)果減去空白，每個(gè)樣品取3個(gè)濃度，分別做3個(gè)重復(fù)。樣品的還原能力由每毫升藍(lán)莓酒中含有的Trolox 含量（μmol）表示，單位μmol/mL。

1.3.2 藍(lán)莓酒總酚含量測定

總酚含量測定采用斐林試劑比色法[13]，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=0.0014x+0.025，R2=0.9908，樣品中的總酚以沒食子酸的含量表示，單位為mg/L。

1.3.3 藍(lán)莓酒總黃酮含量測定

采用硝酸鋁顯色法測藍(lán)莓酒中的總黃酮含量[14]，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=0.0011x-0.0175，R2=0.9961，樣品中的總黃酮以蘆丁的含量表示，單位為mg/L。

1.3.4 藍(lán)莓酒原花色素含量測定

參照SUN B 等[15]方法，采用香草醛-硫酸法測定藍(lán)莓酒中的原花青素含量，以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=0.0007x+0.1812，R2=0.9934，樣品中的總酚以兒茶素的含量表示，單位為mg/L。

1.3.5 藍(lán)莓酒總花色苷含量測定

參考相關(guān)文獻(xiàn)[16-17]，采用pH 值示差法測定藍(lán)莓酒中總花色苷的含量。吸取一定量的藍(lán)莓酒樣分別用鹽酸-氯化鈉緩沖液（pH1.0）和醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.5）稀釋適當(dāng)倍數(shù)（注：樣品稀釋適當(dāng)倍數(shù)使之于稀釋后在波長510nm處測定時(shí)的吸光度值為0.2～0.7為佳）。然后分別在波長510nm和700nm處測定這2種pH值稀釋液的吸光度?？偦ㄉ蘸坑?jì)算公式：

式中：A 為樣品吸光度值；MW為矢車菊素素-3-葡萄糖苷相對分子量，484.82mg/mol；ε 為摩爾吸光系數(shù)24825 mol-1；DF 為樣品稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓酒抗氧化能力

2.1.1 循環(huán)伏安法Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 不同濃度的Trolox的循環(huán)伏安圖（pH=3）Fig.1 Cyclic voltammograms of Trolox at different concentration（pH=3）

圖1反映在不同濃度梯度（0、40μmol/L、80μmol/L、100μmol/L、120μmol/L、160μmol/L、200μmol/L）的Trolox在pH值為3的條件下循環(huán)伏安圖。由圖1可以看出，不同濃度的Trolox產(chǎn)生的陽極峰電流各不相同，隨著濃度的增加，峰電流越高，峰形越明顯，說明抗氧化作用就越強(qiáng)。研究表明采用陽極電勢（＜1200mV）面積能夠反應(yīng)物質(zhì)的總還原能力[18]，因此，根據(jù)不同梯度濃度的Trolox的循環(huán)伏安圖得到各濃度Trolox產(chǎn)生的陽極電勢下的面積，以Trolox標(biāo)品的濃度為橫坐標(biāo)（X），陽極電勢（＜1200mV）下的面積以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=0.0456X+1.103，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。

2.1.2 藍(lán)莓酒抗氧化活性的比較

從表2 可知，6 個(gè)品種藍(lán)莓酒的抗氧化能力在2236.52μmol/L～4402.55μmol/L的范圍內(nèi)，其中，抗氧化能力最強(qiáng)的是黑珍珠和喜來，分別為（4402.55±140.06）μmol/L和（4354.90±98.87）μmol/L，這2個(gè)藍(lán)莓品種的酒的抗氧化能力在本研究中不存在顯著差異；但黑珍珠和喜來這2種藍(lán)莓酒的抗氧化能力顯著高于其他4個(gè)品種藍(lán)莓酒（p＜0.05），都克藍(lán)莓酒的抗氧化能力最低，為（2236.52±51.91）μmol/L。

表2 6種藍(lán)莓酒抗氧化能力Table 2 Antioxidant activity of six different blueberry wines

2.2 藍(lán)莓酒多酚含量的比較分析

2.2.1 藍(lán)莓酒總酚含量比較

圖2 6種藍(lán)莓酒的總酚含量Fig.2 Total phenol content of six different blueberry wines

由圖2 可知，6 種藍(lán)莓酒的總酚含量在482mg/L～930mg/L，由高到低排序?yàn)楹谡渲?、喜來、安娜、燦爛、藍(lán)豐、都克。其中產(chǎn)自遼寧丹東的黑珍珠和山東青島的喜來藍(lán)莓酒的總酚含量顯著高于其他4個(gè)品種的藍(lán)莓酒（p＜0.05），含量分別高達(dá)（930.00±7.35）mg/L和（892.14±13.80）mg/L，含量最低的是產(chǎn)自山東臨沂的都克，為（482.14±38.68）mg/L。

2.2.2 藍(lán)莓酒總黃酮含量比較

圖3 6種藍(lán)莓酒的總黃酮含量Fig.3 Total flavonoid content of six different blueberry wines

圖3反映安娜、都克、藍(lán)豐、喜來、燦爛和黑珍珠6個(gè)藍(lán)莓品種酒總黃酮含量柱狀圖，由圖3可知，喜來藍(lán)莓酒所含的總黃酮含量顯著高于其他5個(gè)品種的藍(lán)莓酒（p＜0.05），高達(dá)（383.79±14.97）mg/L，其次為藍(lán)豐（339.85±9.52）mg/L，后續(xù)從高至低依次為黑珍珠、燦爛、都克藍(lán)莓酒，含量最低的為安娜，為（235.00±4.23）mg/L。

2.2.3 藍(lán)莓酒原花青素含量比較

圖4 6種藍(lán)莓酒的原花青素含量Fig.4 The proanthocyanidin content of six different blueberry wines

從圖4可以看出，采用黑珍珠和喜來藍(lán)莓釀造的藍(lán)莓酒的原花青素的含量最高，分別為（1776.86±58.36）mg/L，（1774.86±22.08）mg/L，均顯著高于其他4種藍(lán)莓酒的含量（p＜0.05），其中，原花青素含量最低的都克品種釀造的藍(lán)莓酒，含量為（481.90±21.58）mg/L。

2.2.4 藍(lán)莓酒總花色苷含量比較

圖5是安娜、都克、藍(lán)豐、喜來、燦爛和黑珍珠6個(gè)藍(lán)莓品種酒總花色苷含量的柱狀圖，總花色苷含量在35.93mg/L～204.28mg/L之間，由圖5可知，采用黑珍珠藍(lán)莓釀造的藍(lán)莓酒的總花色苷的含量最高，為（204.28±10.11）mg/L，其次為喜來藍(lán)莓酒，含量為（185.37±15.69）g/L，這2種藍(lán)莓酒花色苷的含量顯著高于其他4種藍(lán)莓酒（p＜0.05）。此外，花色苷含量最低的安娜品種釀造的藍(lán)莓酒，含量為（35.93±1.01）mg/L。

2.3 不同品種藍(lán)莓酒總抗氧化能力及其總酚、總黃酮、原花青素和總花色苷含量相關(guān)性分析

圖5 6種藍(lán)莓酒的總花色苷含量Fig.5 Total anthocyanin content of six different blueberry wines

從表3可以看出，藍(lán)莓酒的總抗氧化能力與藍(lán)莓酒的總酚、總黃酮、原花青素和總花色苷的含量之間存在顯著的正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到了極顯著水平（p＜0.01），其中總抗氧化能力與原花青素含量的相關(guān)性最強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)為0.8980，其次是與總黃酮含量的相關(guān)性，相關(guān)性最小的是與總花色苷的含量。

表3 不同品種藍(lán)莓酒抗氧化能力、總酚、總黃酮、原花青素和總花色苷含量相關(guān)性Table 3 The relationship of antioxidation,total phenolics,total flavonoids,proanthocyanidin,and total anthocyanin in different blueberry cultivars’wines

3 結(jié)論

本研究的對象是采用6個(gè)不同品種果實(shí)（其中安娜、都克和藍(lán)豐是來自同一產(chǎn)地，而其余3個(gè)品種來自不同的產(chǎn)地）、同一種類的酵母及相同的工藝釀造的藍(lán)莓酒的總抗氧化能力及其總酚、總黃酮、原花青素和總花色苷含量，研究發(fā)現(xiàn)這些不同品種藍(lán)莓酒的總抗氧化能力及其總酚、總黃酮、原花青素和總花色苷含量變幅和變異系數(shù)較大，這表明其存在顯著的品種差異。其中產(chǎn)自遼寧丹東的黑珍珠和山東青島的喜來2個(gè)藍(lán)莓品種酒的抗氧化能力最強(qiáng)。從抗氧化性角度考慮，這2個(gè)品種是供試品種中最適合果酒加工的優(yōu)質(zhì)藍(lán)莓品種，其次是產(chǎn)自山東臨沂的藍(lán)豐品種。

總酚、總黃酮、原花青素和總花色苷都具有抗氧化活性，影響著藍(lán)莓酒的抗氧化能力，本研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓酒的總抗氧化能力與總酚、總黃酮、原花青素和總花色苷含量都存在著顯著的正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到了極顯著水平（p＜0.01），說明藍(lán)莓酒中的多酚物質(zhì)是藍(lán)莓酒抗氧化作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。而總酚、總黃酮、原花青素和總花色苷含量等幾個(gè)指標(biāo)之間相比，原花青素的含量與藍(lán)莓酒的抗氧化能力相關(guān)性最強(qiáng)?？梢宰鳛樗{(lán)莓酒抗氧化性評價(jià)的一個(gè)衡量指標(biāo)。

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