源于自然發(fā)酵腐乳中5’-AMP脫氨酶高產(chǎn)菌株的篩選

梅光明，郭遠(yuǎn)明，饒勝其，張小軍，李佩佩，嚴(yán)忠雍，龍 舉

（1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所 浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316100；2.揚(yáng)州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009）

自然發(fā)酵腐乳也叫腐乳、醬豆腐，為中國(guó)著名的傳統(tǒng)食品，由新鮮豆腐經(jīng)過(guò)發(fā)酵、腌制而成，有“東方奶酪”之稱(chēng)[1-2]。腐乳的制作過(guò)程中有霉菌、乳酸菌和酵母菌等多種微生物共同參與發(fā)酵作用[3-5]。5’-AMP脫氨酶又稱(chēng)腺苷酸脫氨酶、5’-AMP氨基水解酶，是構(gòu)成嘌呤核苷酸代謝循環(huán)的3種主要酶類(lèi)之一。在核酸酶水解核酸制備5’-核苷酸的工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中，約占總量25%的腺苷酸通常沒(méi)有多大用途，而5’-AMP脫氨酶可專(zhuān)一性地將腺苷酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧≤账?，后者可用?lái)生產(chǎn)藥品及強(qiáng)力味精，此外脫氨酶還用于生產(chǎn)細(xì)胞的H+緩沖劑[6]。當(dāng)今核酸酶的研究炙手可熱且成果產(chǎn)出速度飛速提高，勢(shì)必導(dǎo)致市場(chǎng)對(duì)5’-AMP脫氨酶的需求大大增加，因此大規(guī)?；厣a(chǎn)5’-AMP脫氨酶具有廣泛的生產(chǎn)應(yīng)用前景和巨大的經(jīng)濟(jì)效益?，F(xiàn)在工業(yè)生產(chǎn)中使用的生物酶大多由酵母、青霉、曲霉及毛霉等微生物發(fā)酵制備，但有關(guān)生產(chǎn)工藝的報(bào)道卻比較少。本實(shí)驗(yàn)利用自然發(fā)酵腐乳中富集的豐富微生物資源，參考相關(guān)文獻(xiàn)資料報(bào)道的微生物篩選目標(biāo)菌株的方法[7-21]，采用3種固體培養(yǎng)基（PDA、YPD、MRS）對(duì)腐乳中的野生菌株進(jìn)行篩選和平板分離劃線(xiàn)培養(yǎng)，使具有不同菌落特征的菌種分離純化后，測(cè)得各菌株5’-AMP脫氨酶的產(chǎn)量與活性表達(dá)，篩選出5’-AMP脫氨酶的高產(chǎn)菌株，并對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定及一系列的發(fā)酵條件優(yōu)化研究。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)得到一株具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高產(chǎn)5’-AMP脫氨酶菌株，為進(jìn)一步研究5’-AMP脫氨酶的性質(zhì)做準(zhǔn)備，并推動(dòng)其工業(yè)化生產(chǎn)步伐奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

從自然發(fā)酵腐乳中分離。

1.2 培養(yǎng)基制備

PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌20min。。

MRS固體培養(yǎng)基：牛肉膏10.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸膏5.0g，K2HPO42.0g，檸檬酸氫二銨2.0g，乙酸鈉5.0g，吐溫-801.0mL，MgSO4·7H2O0.50g，MnSO40.25g，葡萄糖20.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌20min，調(diào)節(jié)pH值至6.2～6.4。

YPD固體培養(yǎng)基：蛋白胨20.0g，酵母浸膏10.0g，葡萄糖20.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌20min，調(diào)節(jié)pH值至5.0～5.5。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：木糖2.1%，檸檬酸三鈉0.28%，蛋白胨1.4%，硫酸鎂0.035%，吐溫0.084%。121℃滅菌20min。

1.3 試劑

酵母浸膏、牛肉浸膏、蛋白胨、腺苷酸和瓊脂均為生化試劑，其余試劑為分析純。

0.1 mol/L琥珀酸-氫氧化鈉緩沖液：稱(chēng)取琥珀酸11.809g，加蒸餾水約950mL溶解，用1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0，定容至1000mL。

0.08 mol/L NaHCO3：稱(chēng)取NaHCO36.72g，用蒸餾水溶解，定容至1000mL。

10%高氯酸溶液：稱(chēng)取10.0mL高氯酸，加適量水稀釋?zhuān)ㄈ葜?00mL。

5’-AMP反應(yīng)底物：準(zhǔn)確稱(chēng)取139mg腺苷酸，用0.08mol/L NaHCO3溶液定容至10mL，作為原始底物，然后用0.1mol/L琥珀酸-氫氧化鈉緩沖液將其稀釋400倍，得到最終濃度為0.1×10-3mol/L 的反應(yīng)底物。

1.4 儀器與設(shè)備

TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DK-S12型電熱恒溫水浴器：上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；SX-500型高壓蒸汽滅菌鍋：日本TOMMY公司；DGX-9053B-2型生化培養(yǎng)箱：上海福瑪試驗(yàn)設(shè)備有限公司；BS210S型電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；ZHJH-C1209B型垂直流超凈工作臺(tái)：上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；755S紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司。

1.5 方法

1.5.1 自然發(fā)酵腐乳半成品的制備

稱(chēng)取500g市售新鮮豆腐，表面用經(jīng)滅菌處理的自來(lái)水淋洗干凈后切成大小適中的小塊，放置于干凈塑料盒內(nèi)（塑料盒底部預(yù)先放好一層干凈報(bào)紙并鋪上食品保鮮膜），在豆腐表面再鋪上一層保鮮膜后再放上一層報(bào)紙。蓋好塑料盒蓋子后在16℃、濕度85%左右的條件下放置培養(yǎng)5d[22]。

1.5.2 自然發(fā)酵腐乳半成品中產(chǎn)5’-AMP脫氨酶菌株的篩選

取樣：從腐乳半成品上選取菌落特征差別較大的多個(gè)點(diǎn)，分別取樣品2g左右于50mL錐形瓶中，加入無(wú)菌生理鹽水10mL，室溫條件下120r/min搖床提取30min，以此為菌懸液原液。將菌懸液原液按濃度梯度依次稀釋至10-1～10-7。分別取稀釋度為10-5～10-7的3種樣液350μL，用涂布棒均勻涂布于PDA、MRS、YPD培養(yǎng)基。涂布完成后，置于20℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)2h～3h，待水分蒸發(fā)干后，將培養(yǎng)皿倒置繼續(xù)培養(yǎng)48h。

分離純化：選擇涂布濃度適宜的平板，挑取形態(tài)完整、單獨(dú)生長(zhǎng)的菌落分別劃線(xiàn)。用接種環(huán)以無(wú)菌操作沾取少許待分離的菌，在與涂布平板對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基的無(wú)菌平板表面進(jìn)行平行劃線(xiàn)，微生物細(xì)胞數(shù)量將隨著劃線(xiàn)次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開(kāi)來(lái)。劃線(xiàn)完成后置于20℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)2d～3d。重復(fù)劃線(xiàn)培養(yǎng)操作2次，使菌株盡量純化。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：本試驗(yàn)使用250mL錐形瓶，每瓶裝入約50mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，從劃線(xiàn)平板接種后，20℃、200r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)接5%至新的搖瓶中，繼續(xù)搖瓶發(fā)酵3d，培養(yǎng)完成，取樣測(cè)量5’-AMP脫氨酶的活性。

菌種保藏及酶液制備：分別取搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后的菌懸液1mL于1.5mL離心管中，10000r/min離心5min，下層沉淀加500μL 30%甘油，振蕩均勻后于-20℃冰箱中保藏，即為種子。甘油保藏適用于中期或長(zhǎng)期保藏菌種。而上層清液即是酶液，可用于測(cè)定5’-AMP脫氨酶的活性。

5’-AMP脫氨酶活性的測(cè)定：將酶液樣品稀釋8倍備用，按照文獻(xiàn)[23]的方法測(cè)定5’-AMP脫氨酶的活性，每個(gè)樣品做3組平行實(shí)驗(yàn)，平行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別計(jì)算得到酶活后取平均值。

1.5.3 菌種鑒定

在倒好培養(yǎng)基平皿中，用接種針從斜面挑取少許孢子在培養(yǎng)皿中按三角頂點(diǎn)位置三點(diǎn)式接種。PDA培養(yǎng)基平皿在20℃培養(yǎng)3d～5d。形成菌落后進(jìn)行特征觀(guān)察并記錄。對(duì)5’-AMP脫氨酶高產(chǎn)菌株進(jìn)行分類(lèi)鑒定

1.5.4 發(fā)酵條件對(duì)5’-AMP脫氨酶高產(chǎn)菌株產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響：挑取單獨(dú)生長(zhǎng)的純種菌落于裝有50mL不同pH值的液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，錐形瓶用8層紗布封口。20℃、200r/min搖床培養(yǎng)24h。發(fā)酵培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)接5%（v/v，下同）至新的裝有約50mL液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中繼續(xù)培養(yǎng)72h。培養(yǎng)后的酶液用于測(cè)定5’-AMP脫氨酶的活性。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響：操作同1.5.4，比較不同溫度條件下?lián)u床培養(yǎng)的酶液酶活大小。

接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響：操作同1.5.4，比較不同接種量至裝有約50mL液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中繼續(xù)培養(yǎng)72h后的酶液酶活大小。

搖瓶發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響：操作同1.5.4，比較轉(zhuǎn)接5%至裝有約50mL液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)培養(yǎng)后的酶液酶活大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆腐乳半成品制備及取樣點(diǎn)設(shè)置

圖1 市售新鮮豆腐（a）及放置5d后自然發(fā)酵腐乳半成品（b）Fig.1 Fresh tofu (a) and semi-finished tofu products after 5d natural fermentation (b)

市售新鮮豆腐見(jiàn)圖1a，放置5d后自然發(fā)酵腐乳半成品見(jiàn)圖1b。由圖1b可知，此時(shí)腐乳上的微生物已經(jīng)生長(zhǎng)十分旺盛。選取具有明顯菌落特征的取樣點(diǎn)，共計(jì)7個(gè)，分別記為A、B、C、D、E、F、G。

圖2 特征性涂布平板Fig.2 Characteristic coated tablet

圖2a為在YPD培養(yǎng)基上涂布分離豆腐乳中野生菌株的典型情況；圖2b為在MRS培養(yǎng)基上涂布分離豆腐乳中野生菌株的典型情況；圖2c為在PDA培養(yǎng)基上涂布分離豆腐乳中野生菌株的典型情況。

涂布完成后，挑取涂布平板上生長(zhǎng)單一的特征菌落，依據(jù)純化情況，劃線(xiàn)2次或3次。共得到單一菌株36株，從PDA平板上得到20株，YPD平板上得到9株，MRS平板上得到7株。根據(jù)培養(yǎng)基種類(lèi)不同，依次編號(hào)為DFP-101～120（PDA培養(yǎng)基），同樣有DFY-101～109（YPD培養(yǎng)基），DFM-101～107（MRS培養(yǎng)基）。

2.2 腐乳分離菌株的酶活測(cè)量結(jié)果

從自然發(fā)酵腐乳中篩選得到單一菌株共36株，在接種量5%，20℃、200r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下發(fā)酵72h，分別測(cè)得5’-AMP脫氨酶活性，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 具有產(chǎn)酶能力的菌株酶活測(cè)量結(jié)果Table 1 Enzyme activity measurements of strains with ability of enzyme production

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，具有5’-AMP脫氨酶活性的共計(jì)18株，且這些具有5’-AMP脫氨酶產(chǎn)酶能力的菌株多數(shù)在PDA培養(yǎng)基上篩選得到，說(shuō)明產(chǎn)5’-AMP脫氨酶的菌株較多為霉菌。編號(hào)為DFP-102的菌株為5’-AMP脫氨酶的最高產(chǎn)菌株，在上述發(fā)酵條件下，5’-AMP脫氨酶的活力達(dá)到359.1U/mL。故選取此菌株進(jìn)行下一步的發(fā)酵優(yōu)化及菌種鑒定試驗(yàn)。

2.3 菌種初步鑒定結(jié)果

圖3 DFP-102菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology of DFP-102

圖3a為DFP-102的PDA培養(yǎng)基三點(diǎn)式培養(yǎng)菌落圖，圖3b為圖3a右上角菌落的放大圖。觀(guān)察DFP-102的菌落形態(tài)：灰色絮狀，菌落中間有小圓，邊緣呈白色，有同心圓，反面淺黃色。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)資料[24-25]初步鑒定DFP-102分離菌株是毛霉菌屬。

2.4 發(fā)酵條件對(duì)DFP-102菌株產(chǎn)酶的影響

2.4.1 發(fā)酵液初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

按照1.5.4的方法實(shí)驗(yàn)操作，結(jié)果（圖4）可知，在pH值為4.0～6.0時(shí)，酶活隨pH值的增加而增加，在pH值為6.0時(shí)，酶活達(dá)到最大值，此時(shí)5’-AMP脫氨酶活是359.1U/mL，當(dāng)pH值高于6.0以后，酶活隨pH值的增加而下降。因此培養(yǎng)液的初始pH值確定為6.0。

2.4.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

按照1.5.4的方法實(shí)驗(yàn)操作，結(jié)果（圖5）可知，在18℃～24℃時(shí)，隨著溫度的上升，5’-AMP脫氨酶活性逐漸上升，在24℃時(shí)，酶活達(dá)到最高，此時(shí)5’-AMP脫氨酶活是390.6U/mL。隨溫度繼續(xù)上升，5’-AMP脫氨酶活性逐漸下降。因此搖床發(fā)酵培養(yǎng)溫度應(yīng)控制為24℃左右。

圖4 發(fā)酵液初始pH值對(duì)酶活的影響Fig.4 Effect of initial pH value of the fermented liquid on enzyme activity

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)酶活的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on enzyme activity

2.4.3 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖6 接種量對(duì)酶活的影響Fig.6 Effect of inoculum on enzyme activity

按照1.5.4的方法實(shí)驗(yàn)操作，結(jié)果（圖6）可知，接種量大于5%后，隨著接種量的增加，酶活開(kāi)始降低，因此接種量應(yīng)選為5%，此時(shí)5’-AMP脫氨酶活性是390.6U/mL。

2.4.4 搖瓶發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

按照1.5.4的實(shí)驗(yàn)方法操作，結(jié)果（圖7）可知，在12h～48h內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶的活性逐漸提高，發(fā)酵48h時(shí)酶活最高，此時(shí)5’-AMP脫氨酶活是472.3U/mL，繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，酶活逐漸降低，因此發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間確定為48h。

圖7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶活的影響Fig.7 Effect of fermentation time on enzyme activity

3 結(jié)論

本研究從自制的自然發(fā)酵腐乳中進(jìn)行菌株的分離與純化，篩選出單一菌株36株，其中檢測(cè)到具有5’-AMP脫氨酶活性的有18株。酶活最高的菌株為DFP-102（初步鑒定為毛霉菌屬，酶活為359.1U/mL）。經(jīng)過(guò)搖床發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化，DFP-102菌株產(chǎn)5’-AMP脫氨酶的最適宜發(fā)酵條件為培養(yǎng)基pH值為6.0，發(fā)酵溫度24℃，發(fā)酵時(shí)間48h，5%接種量。在該最佳發(fā)酵條件培養(yǎng)菌株后，5’-AMP脫氨酶活性可達(dá)472.3U/mL。本研究篩選得到的高產(chǎn)5’-AMP脫氨酶活性菌株來(lái)源于傳統(tǒng)發(fā)酵食品，具有較低的食品安全風(fēng)險(xiǎn)，且采用液體發(fā)酵培養(yǎng)法，生產(chǎn)周期較短，有利于5’-AMP脫氨酶大規(guī)模化生產(chǎn)并降低生產(chǎn)成本。后續(xù)將開(kāi)展進(jìn)一步的研究工作，包括DFP-102菌株的生化鑒定，嘗試對(duì)DFP-102進(jìn)行菌株誘變得到更高的5’-AMP脫氨酶高產(chǎn)菌株，對(duì)于5’-AMP脫氨酶的性質(zhì)研究，如穩(wěn)定性，耐熱性等也有待進(jìn)一步展開(kāi)。本研究為5’-AMP脫氨酶的性質(zhì)研究以及工業(yè)化生產(chǎn)打下了一定的基礎(chǔ)。

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