熒光法鑒別蘋果汁摻偽的研究

左錦靜

（河南工業(yè)貿(mào)易職業(yè)學(xué)院，河南 鄭州 450012）

濃縮蘋果汁是我國最主要的蘋果加工產(chǎn)品，在世界蘋果加工總量中占到90%以上[1]，是世界第二大果汁消費(fèi)品，僅次于橙汁。目前蘋果汁已成為深受我國廣大消費(fèi)者喜愛的一種健康飲品，其營養(yǎng)價(jià)值和食療功效都很高。據(jù)報(bào)道，鮮蘋果汁在抗癌方面有積極作用，其中L-蘋果酸能夠抑制癌細(xì)胞擴(kuò)散，防止過度肥胖，增加人體血色素、增加皮膚紅潤(rùn)度，而且可刺激胃液分泌、促進(jìn)消化[2]。然而在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，一些不法廠商往往會(huì)生產(chǎn)一些名不副實(shí)甚至以假充真的蘋果汁。這不僅會(huì)影響果汁行業(yè)的健康發(fā)展和市場(chǎng)秩序的良好運(yùn)行，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且有損消費(fèi)者健康，更會(huì)對(duì)構(gòu)建和諧社會(huì)帶來諸多不良后果[3]。按照果汁的定義，可以把任何添加了外來物質(zhì)的果汁說成摻假果汁，因?yàn)樵诠惍a(chǎn)品中添加任何外來物質(zhì)都是不被允許的，除了在生產(chǎn)還原果汁時(shí)，才可在濃縮果汁原料中添加果汁濃縮時(shí)失去的量相同的水[4]。近年來，針對(duì)果汁摻假問題，國內(nèi)外許多學(xué)者進(jìn)行了不同程度的研究，取得了較好成果[3]。

利用熒光分光光度計(jì)研究蘋果汁的熒光特性，并對(duì)蘋果汁常見摻偽物質(zhì)的熒光特性進(jìn)行測(cè)定分析，以期為熒光法快速鑒別蘋果汁摻假提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果汁：從自由市場(chǎng)隨機(jī)取樣。

試劑：青蘋果香精、青蘋果（芬達(dá)型）香精、紅富士香精：杭州安賽生物科技有限公司；檸檬黃（95%）、亮藍(lán)（85%）：Aladdin Chemistry Co.Ltd；抗壞血酸（分析純）：洛陽市化學(xué)試劑廠；檸檬酸（分析純）：宿州化學(xué)試劑廠；山梨酸（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；甜蜜素，50倍；苯甲酸鈉（分析純）：洛陽市化學(xué)試劑廠；山梨酸鉀（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；蔗糖（分析純）；D-果糖（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)（美國，瓦里安公司），儀器序列號(hào)EL06053220。

熒光分光光度計(jì)參數(shù)設(shè)置如下：掃描速度，中速（600nm/min）；平均時(shí)間0.1s；靈敏度，高；激發(fā)夾縫，5nm；發(fā)射夾縫，5nm。

針頭過濾膜：尼龍6，孔徑0.45μm。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原材料處理

將在自由市場(chǎng)上隨機(jī)買到的蘋果汁飲料用離心機(jī)過濾，8000r/min離心10min。離心后的上清液用濾紙過濾，收集濾液，備用。蘋果汁在移入比色皿之前需先通過0.45微米的針頭過濾膜。

1.3.2 摻假物質(zhì)溶液的配制

摻假物質(zhì)溶液的配制：將飲料中常見摻假物質(zhì)分別按其在飲料中的最大允許使用量配制成溶液。其中：VC 0.5g/kg；甜蜜素0.65g/kg；檸檬酸0.1%；山梨酸0.1%；檸檬黃0.1g/kg；蘋果香精0.1%；苯甲酸鈉1.0g/kg；山梨酸鉀0.5g/kg；亮藍(lán)0.025g/kg。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳工作波長(zhǎng)的確定

以一系列不同品牌的100%蘋果汁為目標(biāo)溶液，進(jìn)行熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜掃描，確定最佳工作波長(zhǎng)。這里以塞浦麗娜牌100%蘋果汁為例對(duì)得到的圖譜加以說明。

對(duì)塞浦麗娜牌100%蘋果汁進(jìn)行零級(jí)激發(fā)掃描，得到零級(jí)激發(fā)光譜圖（見圖1）。由圖1可以看出，在波長(zhǎng)380nm、616nm、791nm處塞浦麗娜牌100%蘋果汁都有較強(qiáng)熒光強(qiáng)度的體現(xiàn)，分別以上述3種波長(zhǎng)為激發(fā)波長(zhǎng)進(jìn)行熒光發(fā)射掃描，結(jié)果表明，只有當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為380nm時(shí)有發(fā)射峰，峰值為461nm；再以461nm為發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行熒光激發(fā)掃描得到基本呈鏡像對(duì)稱的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜（見圖2），這說明塞浦麗娜牌100%蘋果汁在激發(fā)波長(zhǎng)為380nm處確有熒光。

圖1 塞浦麗娜牌100%蘋果汁零級(jí)激發(fā)光譜圖Fig.1 Zero level excitation spectrum of Cyprina 100% apple juice

以380nm波長(zhǎng)附近范圍為激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)塞浦麗娜牌100%蘋果汁進(jìn)行3D發(fā)射掃描，得其一系列發(fā)射光譜（見圖3），并生成相應(yīng)的等值圖（見圖4）。根據(jù)圖3和圖4選取450nm附近范圍為發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行熒光激發(fā)掃描，得一系列熒光激發(fā)光譜（見圖5），并生成等值圖（見圖6）。

圖2 塞浦麗娜牌100%蘋果汁380nm激發(fā)下的發(fā)射光譜及461nm發(fā)射下的激發(fā)光譜Fig.2 Emission spectra at 380nm and excitation spectrum at 461nm of Cyprina 100% apple juice

圖3 塞浦麗娜牌100%蘋果汁360nm～400nm的3D發(fā)射光譜圖Fig.3 3D Emission spectra of Cyprina 100% apple juice at 360nm～400nm

圖4 塞浦麗娜牌100%蘋果汁360nm～400nm的3D發(fā)射光譜等值圖Fig.4 3D Emission spectra contour figure of Cyprina 100% apple juice at 360nm～400nm

圖5 塞浦麗娜牌100%蘋果汁440nm～490nm的3D激發(fā)光譜Fig.5 3D excitation spectrum of Cyprina 100% apple juice at 440-490nm

圖6 塞浦麗娜牌100%蘋果汁440nm～490nm的3D激發(fā)光譜等值圖Fig.6 3D excitation spectrum contour figure of Cyprina 100% apple juice at 440nm～490nm

同時(shí)，可以得到其他3種100%蘋果汁的激發(fā)光譜及其對(duì)應(yīng)的3D激發(fā)光譜等值圖（見圖7～12）。

圖7 大湖牌100%蘋果汁450nm～470nm的3D激發(fā)光譜Fig.7 3D excitation spectrum of Great Lake 100% apple juice at 450nm～470nm

圖8 大湖牌100%蘋果汁450nm～470nm的3D激發(fā)光譜等值圖Fig.8 3D excitation spectrum contour figure of Great Lake 100%apple juice at 450 nm～470nm

圖9 匯源牌100%蘋果汁450nm～495nm的3D激發(fā)光譜Fig.9 3D excitation spectrum of Huiyuan 100% apple juice at 450nm～495nm

圖10 匯源牌100%蘋果汁450nm～495nm的3D激發(fā)光譜等值圖Fig.10 3D excitation spectrum contour figure of Huiyuan 100%apple juice at 450 nm～495nm

圖11 發(fā)那牌100%蘋果汁450nm～490nm的3D激發(fā)光譜Fig.11 3D excitation spectrum of Pfanner 100% apple juice at 450nm～490nm

圖12 發(fā)那牌100%蘋果汁450nm～490nm的3D激發(fā)光譜等值圖Fig.12 3D excitation spectrum contour figure of Pfanner 100%apple juice at 450 nm～490nm

由圖6～12并結(jié)合熒光強(qiáng)度初步選定379nm為最佳激發(fā)波長(zhǎng)。以379nm為激發(fā)波長(zhǎng)，分別對(duì)上述4種品牌100%蘋果汁進(jìn)行發(fā)射掃描，得到發(fā)射光譜（見圖13）。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定最佳工作波長(zhǎng)：最佳激發(fā)波長(zhǎng)379nm，最佳發(fā)射波長(zhǎng)463nm。

2.2 摻假物質(zhì)的熒光掃描

在379nm激發(fā)波長(zhǎng)和已定儀器條件下，分別對(duì)各種摻假物質(zhì)溶液進(jìn)行熒光掃描，得到各種摻假物質(zhì)溶液的發(fā)射光譜（見圖14和圖15）。結(jié)果表明，幾種常見的摻假物質(zhì)在379nm激發(fā)波長(zhǎng)下，在波長(zhǎng)454nm～465nm處均沒有熒光或熒光強(qiáng)度很弱，可見這些摻假物質(zhì)并不影響蘋果汁原有的熒光特性。

圖13 匯源、大湖、發(fā)那、塞浦麗娜四種品牌100%蘋果汁379nm發(fā)射光譜Fig.13 Emission spectra of Huiyuan,Great Lakes,Pfanner and Cyprina 100% apple juice at 379nm

圖14 各種摻偽物質(zhì)在379nm處的發(fā)射光譜（蔗糖、VC、甜蜜素、檸檬酸、果糖、檸檬黃、0.1%青蘋果香精、0.1%紅富士香精、日落黃）Fig.14 Emission spectra of all kinds of adulterated substance at 379nm (sucrose,VC,sodium cyclamate,citric acid,fructose,citric yellow,0.1% green apple flavor,0.1%Red Fuji flavor,sunset yellow)

圖15 山梨酸鉀、苯甲酸鈉、安賽蜜和亮藍(lán)在379nm處的發(fā)射光譜Fig.15 Emission spectra of potassium sorbate,sodium benzoate,acesulfame-K and brilliant blue at 379nm

因此，本試驗(yàn)所得到的蘋果汁熒光特性可用于檢測(cè)完全配置型蘋果汁摻假，即真蘋果汁在379nm激發(fā)波長(zhǎng)下，在454nm～465nm處有最大發(fā)射峰；而假蘋果汁則無此熒光特性。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及樣品溶液的測(cè)定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

由圖13可知，在379nm激發(fā)下，對(duì)于相同濃度的蘋果汁，大湖牌蘋果汁熒光強(qiáng)度最大、匯源牌蘋果汁熒光強(qiáng)度最小。因此選取大湖牌100%蘋果汁配制一定濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，并在已確定工作波長(zhǎng)處和已確定的儀器條件下，測(cè)定其熒光強(qiáng)度（見表1）。

表1 大湖牌蘋果汁系列溶液的熒光強(qiáng)度測(cè)定值Table 1 Fluorescence intensity of Great Lakes apple juice series solution

由表1可以看出，熒光強(qiáng)度與溶液濃度呈正比，即IF=KF·c（其中IF為熒光強(qiáng)度，KF為常數(shù)，c為樣品濃度），但這種線性關(guān)系只在極稀的溶液中才成立，對(duì)于較濃的溶液，由于猝滅現(xiàn)象和自吸收等原因，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度與濃度不呈線性關(guān)系[5]。所以，本文選取線性關(guān)系較好的濃度為10%～30%的點(diǎn)制做標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖16），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：IF=1.3905·c+10.575，其中IF為熒光強(qiáng)度/a.u.，c為溶液濃度/%，回歸系數(shù)為0.9716。

圖16 大湖蘋果汁濃度10%～30%的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.16 The standard curve of Great Lakes apple juice concentration 10%～30%

2.3.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在相同測(cè)定條件下，測(cè)定含原果汁的樣品溶液的熒光強(qiáng)度。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線或標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出被測(cè)樣品溶液中原果汁的含量。在市場(chǎng)隨機(jī)選取3種蘋果汁進(jìn)行測(cè)定，其樣品編號(hào)、標(biāo)簽上標(biāo)示的果汁含量、測(cè)定結(jié)果及計(jì)算結(jié)果見表2。

表2 市售果汁樣品中原果汁含量的測(cè)定Table 2 Determination of raw juice content for commercial fruit juice samples

由表2可知，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出的蘋果汁飲料中的原果汁含量與標(biāo)簽上標(biāo)示的果汁含量基本相符。

2.4 溫度對(duì)蘋果汁熒光特性的影響

配制20%和80%的匯源蘋果汁標(biāo)準(zhǔn)溶液，在已確定工作波長(zhǎng)處和已確定的儀器條件下分別測(cè)定其在常溫和冷藏條件下（冷藏時(shí)間為7h）的熒光強(qiáng)度（見表3）。結(jié)果表明熒光強(qiáng)度隨溫度升高而降低，這符合一般熒光測(cè)定規(guī)律。這也說明在確定最佳工作條件及測(cè)定蘋果汁飲料中原果汁近似含量時(shí)應(yīng)盡量保持溫度一致。

表3 溫度對(duì)蘋果汁熒光強(qiáng)度的影響Table 3 Effect of temperature on fluorescence intensity of apple juice

3 結(jié)論

（1）確定最佳工作波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)379nm，發(fā)射波長(zhǎng)463nm。

（2）VC、蔗糖、果糖、甜蜜素、安賽蜜、檸檬酸、檸檬黃、日落黃、亮藍(lán)、0.1%青蘋果香精、0.1%紅富士香精、山梨酸鉀、苯甲酸鈉等蘋果汁中常見的摻假物質(zhì)以及配制的模擬蘋果汁在最佳工作波長(zhǎng)處基本無熒光強(qiáng)度或熒光強(qiáng)度很弱，這表明上述物質(zhì)對(duì)蘋果汁的熒光特性無干擾。

（3）本試驗(yàn)所得到的蘋果汁熒光特性可用于檢測(cè)完全配制型蘋果汁摻假，即真蘋果汁在379nm激發(fā)波長(zhǎng)下，在463nm處有最大發(fā)射峰；而假蘋果汁則無此熒光特性。另外，可通過標(biāo)準(zhǔn)曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算低濃度蘋果汁飲料中原果汁含量。

（4）蘋果汁的熒光強(qiáng)度隨溫度升高而降低，所以測(cè)定時(shí)應(yīng)盡可能保證溫度條件一致。

4 展望

近年來，熒光分析法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于果汁的檢測(cè)。如胡耀星等[6]用熒光法鑒定柑桔汁飲料摻假，該方法快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏度高。表面熒光法激發(fā)-發(fā)射矩陣被應(yīng)用于評(píng)估熱處理蘋果汁中的非酶褐變，該方法為監(jiān)控果汁的非酶褐變提供了一個(gè)可行的方法[5]。熒光分析法已在果汁檢測(cè)中初有成就，而且該方法優(yōu)勢(shì)明顯，但該法也有不足之處，如在測(cè)定時(shí)受溶劑、溫度、溶液的pH值等的影響。相信在科研工作者的共同努力下，該領(lǐng)域的應(yīng)用研究一定能夠取得突破性進(jìn)展，熒光分析法也將越來越多地被應(yīng)用于果汁質(zhì)量檢測(cè)中[7]。

[1]黎未然，高志明.中紅外光譜法評(píng)價(jià)蘋果濃縮汁質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（12）：98-100.

[2]魏德保.果品營養(yǎng)與食療[M].北京：中國林業(yè)出版社，1987.

[3]韓建勛，陳 穎，黃文勝，等.蘋果汁鑒偽技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品科技，2008（8）：205-208.

[4]朱孔岳，周 靜，高一璇，等.蘋果汁中果汁含量測(cè)定方法研究[J].檢測(cè)與分析，2010，13（5）：29-33.

[5]ZHU DZ,JI BAOPING.Evaluation of the non-enzymatic browning in thermally processed apple juice by front-face fluorescence spectroscopy[J].Food Chem，2009，113：272-279.

[6]胡耀星，袁三喜.熒光法鑒定柑桔汁飲料摻假[J].分析檢測(cè)，2005，26（5）：166-168.

[7]楊玉玲，劉海樂.熒光分析在農(nóng)藥研究中的應(yīng)用[J].生命科學(xué)儀器，2007，5（9）：9-12.