誘導激活劑對不同曲霉菌株淀粉酶組分的激活作用

張賀迎，徐新霞，任 磊，武金霞*

（1.河北大學 生物技術研究中心，河北 保定 071002；2.河北大學 生命科學院，河北 保定 071002）

醬油是中國傳統(tǒng)的釀造調味品，是釀造微生物多種酶系協(xié)同作用于物料的結果。釀造微生物在生長繁殖過程中會分泌蛋白酶、淀粉酶、果膠酶等多種酶系，這些酶的活力、含量及比例影響醬油的產量和質量[1-2]。氨基酸態(tài)氮目前仍是衡量醬油釀造質量和產量的重要指標，在研究和生產中，常以米曲霉蛋白酶活力高低衡量菌株性能和跟蹤醬油釀造過程[3-4]。但醬油是集色、香、味、體于一體的調味品，醬色是衡量醬油感官質量的重要組成部分，其形成主要依賴于非酶促褐變反應，即醬醪中的蛋白質原料、淀粉質原料及其分解產物氨基酸、單糖類等物質在一定條件下發(fā)生美拉德化學反應[5-7]。

淀粉酶是指能催化淀粉轉化成葡萄糖、麥芽糖及其他低聚糖的所有酶的總稱，在醬油色、香、味、體的形成中起重要作用[8]。成曲中淀粉酶的組成及活力對醬油的品質有重要的影響[9]。

米曲霉（Aspergillusoryzae）和黑曲霉（Aspergillusniger）是釀造醬油制曲的重要微生物，不同菌株具有自身的特性。本實驗室發(fā)明的激活釀造技術能提高醬油產量和質量，縮短發(fā)酵周期[10-13]。研究誘導激活劑對菌株淀粉酶組分及活性的影響，為了解誘導激活劑對不同菌株的激活特異性及淀粉酶在醬油釀造中的作用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

米曲霉（Aspergillus oryzae）滬釀3.042、米曲霉3.362、米曲霉HL、米曲霉ZH、米曲霉3042KG；黑曲霉（Aspergillus niger）滬釀3350、黑曲霉3.324。

豆粕麩皮固體培養(yǎng)基；Tris，可溶性淀粉，SDS，TritonX-100，丙烯酰胺及甲叉雙丙烯酰胺等。

1.2 主要儀器和設備

BG-Power 600電泳儀（BAYGENE），電泳槽（北京六一儀器廠，24D），凝膠成像儀Bio-Best 300M（SIM INTERNATION），水浴鍋，SH-5磁力攪拌器（BeiDe）。

1.3 方法

1.3.1 醬油成曲浸提液的制備

[14]，制備成曲浸提液。

1.3.2 淀粉酶活力測定

參考文獻[15]，采用DNS顯色法測定淀粉酶活力，酶活力單位定義為：在pH5.6檸檬酸緩沖液，溫度為4.0℃的條件下，5min內水解20mg淀粉產生1mg麥芽糖的酶量為一個酶活力單位，以U表示。

1.3.3 Starch-PAGE檢測浸提液淀粉酶組分數(shù)量及活性比例分析

參考文獻[14]作相應的改進，使用凝膠成像分析軟件Quantity One_v4.4.0.36分析膠中各條帶組分的活性比例。

2 結果

2.1 誘導激活劑對各菌株淀粉酶組分的影響

圖1 各菌株淀粉酶活性電泳圖譜Fig.1 Electropherogram of amylase activity of each strain

由圖1可知，（1）7個曲霉菌株成曲浸提液的淀粉酶組分數(shù)量不同，黑曲霉滬釀3350、黑曲霉3.324、米曲霉3.362和米曲霉HL均含有4個淀粉酶組分，而米曲霉3.042和米曲霉3042KG含有3個淀粉酶組分，米曲霉ZH含有2個淀粉酶組分。（2）對于每一個菌株而言，誘導激活劑沒有改變淀粉酶組分的數(shù)量，只提高了不同淀粉酶組分的活力，進而提高了總淀粉酶活力。（3）將含有4個組分的黑曲霉滬釀3350、黑曲霉3.324、米曲霉3.362和米曲霉HL的組分按遷移率由小到大編號為1、2、3和4，比較7個菌株淀粉酶組分的遷移率?？梢姡浊箿?.042和米曲霉3.042KG顯示3個淀粉酶組分，分別與組分2、3、4對應，而米曲霉ZH顯示2個淀粉酶組分，分別與組分2、3對應。此外，從淀粉酶條帶的透明度分析，組分2是7個菌株中活力最高的組分，在醬油釀造淀粉類物質的降解中可能起主要作用。（4）誘導激活劑對7個菌株不同淀粉酶組分的誘導激活作用不同。對米曲霉滬釀3042的組分4、黑曲霉滬釀3.350的組分4、黑曲霉3.324的組分1、米曲霉HL的組分1和3、米曲霉ZH的組分3、米曲霉3.042KG的組分2和3均有較強的激活作用。

2.2 誘導激活劑對各菌株淀粉酶總活力的影響

由圖2可知，添加誘導激活劑以后，各菌株的總淀粉酶活力均有提高，但是由于不同菌株的不同淀粉酶組分對激活劑的敏感性不同（見圖1），導致不同菌株總淀粉酶活力的提高程度不同，7個菌株的淀粉酶活力提高分別為15.55%、9.64%、5.42%、14.55%、14.77%、11.14%、15.24%。

3 討論

米曲霉3.362、HL、ZH、3.042KG是在米曲霉滬釀3.042傳代過程中分離出的變異菌株，已經應用于醬油工業(yè)生產，經過變異后的各菌株在淀粉酶組分構成和活力分布上也發(fā)生了變化。黑曲霉3.350和3.324廣泛用于制醋工業(yè)，2菌株的淀粉酶活力高于米曲霉菌株（圖2），但對激活劑的敏感性較米曲霉菌株差。本研究通過活性PAGE直觀觀察到各菌株淀粉酶組分及活性差異，對進一步研究誘導激活劑對不同菌株在醬油生產的作用打下了基礎。

圖2 激活對各菌株淀粉酶活力的影響Fig.2 Effect of activation on amylase activity of each strain

參考文獻：

[1]魯肇元.醬油的質量標準[J].中國調味品，2002，12（12）：41-43.

[2]趙德安.我國醬油釀造工藝的演變與發(fā)展趨勢[J].中國釀造，2009，28（9）：15-17.

[3]XU D,PAN L,ZHAO H,et al.Breeding and identification of novel koji molds with high activity of acid protease by genome recombination betweenAspergillus oryzaeandAspergillus niger[J].J Ind Microbiol Biotech，2011，38（9）：1255-1265.

[4]曾小波，伍麗瑜，宋小焱，等.醬油曲蛋白酶的分離及催化性質研究[J].中國調味品，2010，35（1）：50-52.

[5]呂東津，梁姚順，宋小焱.醬油的色、香、味[J].中國調味品，2004，7（7）：7-9.

[6]王春玲，張博華，崔 琪，等.影響醬油色澤和色調因素的分析[J].中國釀造，2010，29（7）：80-82.

[7]陳 敏，韓小麗，蔣予箭，等.釀造醬油呈色機制及色澤評價研究進展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（1）：116-119.

[8]KIM HR,KIM JH,BAI DH,et al.Identification and characterization of useful fungi with α-amylase activity from the Korean traditional Nuruk[J].Mycobiology，2011，39（4）：278-282.

[9]NEMOTO T,MARUYAMA J,KITAMOTO K.Contribution ratios of amyA,amyB,amyC genes to high-level α-amylase expression inAspergillus oryzae[J].Biosci Biotech Biochem，2012，76（8）：1477-1483.

[10]張賀迎，武金霞.用激活釀造法提高醬油的生產效率[J].中國調味品，2002（9）：22-24.

[11]張賀迎，武金霞，劉文娜.日本醬油縮短發(fā)酵周期的研究[J].中國調味品，2008（1）：22-23，34.

[12]張賀迎，王建平，武金霞，等.激活釀造提高醬油中氨基酸總量及優(yōu)化氨基酸比例[J].中國釀造，2011，30（4）：105-107.

[13]武金霞，程會欣，張賀迎.激活劑對米曲霉孢子萌發(fā)率的影響[J].中國調味品，2010，35（3）：58-61.

[14]武金霞，閆 博，張賀迎，等.活性染色電泳鑒定醬油成曲中的淀粉酶組分[J].中國調味品，2010，35（1）：74-77.

[15]喻鳳香，陳 煦，林親錄，等.酒曲根霉的分離純化及淀粉酶活力測定[J].釀酒，2006，33（3）：39-41.