響應(yīng)面法優(yōu)化魚皮膠原蛋白多肽螯合鋅工藝

陳 孟，楊會成，周宇芳，廖妙飛，馬華威，鄭 斌*

（1.浙江海洋學(xué)院，浙江 舟山 316000；2.浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江 舟山 316100）

膠原蛋白多肽是膠原或明膠經(jīng)蛋白酶等降解處理后制得的具有較高消化吸收性、分子量約為2000u～30000u的產(chǎn)物，不具有明膠的凝膠性能。目前市場上的膠原幾乎都是膠原多肽[1]。在20世紀(jì)60、70年代就有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，小的肽段和氨基酸能夠促進(jìn)鋅元素的吸收[2-4]。鋅是人體必需的微量元素之一，也是體內(nèi)多種重要酶的組成成分和酶的激活劑[5]。研究證明，膠原蛋白多肽螯合鋅具有提高飼料利用率、改善動物生產(chǎn)性能、促進(jìn)鋅和其他礦物元素的吸收以及促進(jìn)動物生長發(fā)育、抗氧化和提高動物機(jī)體免疫力等作用，是理想的補(bǔ)鋅劑[6-7]。因此，開展膠原蛋白多肽與鋅最優(yōu)螯合工藝條件的研究，可以為今后工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

本試驗采用響應(yīng)面法對魚皮膠原蛋白多肽與鋅的螯合工藝進(jìn)行優(yōu)化，重點(diǎn)分析研究了魚皮膠原肽與硫酸鋅的質(zhì)量比、螯合時間、螯合溫度、酸堿度等因素對螯合率響應(yīng)值的影響及變化規(guī)律，并對螯合物進(jìn)行紫外光譜學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚皮膠原蛋白多肽：由浙江海力生生物科技有限公司提供；硫酸鋅、茚三酮、無水乙醇、氫氧化鈉等所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CR21G型高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司；85-1型恒溫磁力攪拌器：國華電器有限公司；DECTA320A/C型pH計：瑞士梅特勒托利多公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋：上海棱光技術(shù)有限公司；UV-2102C型紫外可見分光光度計：上海尤尼珂儀器有限公司；TD3102型臺式電子天平：余姚金諾天平儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魚皮膠原肽與鋅的螯合工藝[8-11]

粉狀魚皮膠原蛋白多肽→加水溶解→攪拌調(diào)pH值→按比例加入硫酸鋅→攪拌控溫螯合→過濾→濃縮→加入無水乙醇析出沉淀→抽濾→洗滌→真空冷凍干燥→膠原肽鋅螯合物

1.3.2 魚皮膠原肽與鋅螯合率的測定[12-14]

準(zhǔn)確量取10mL膠原肽鋅螯合物的濃縮液，并定容于100mL容量瓶中，搖勻備用。然后采用EDTA絡(luò)合滴定法測定螯合液中微量元素鋅的總量。另在100mL燒杯中移入10mL膠原肽鋅螯合物濃縮液，加熱濃縮至盡干，然后加入50mL無水乙醇，水浴溫?zé)岵⒊浞謹(jǐn)嚢?。將上述混合液用高速冷凍離心機(jī)離心分離，所得沉淀用水溶解定容于100mL容量瓶中，搖勻，用EDTA絡(luò)合滴定法測定螯合態(tài)中微量元素鋅的含量。EDTA絡(luò)合滴定法：用移液管準(zhǔn)確移取25mL待測液于250mL錐形瓶中，加入50mL水，滴加2～3滴二甲酚橙指示劑，用預(yù)先配制好的0.02mol/L EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，溶液顏色由紫紅變?yōu)榱咙S色即為滴定終點(diǎn)。

式中：C為EDTA溶液的濃度，mol/L；V1為滴定螯合態(tài)鋅所消耗的EDTA溶液體積，mL；V0為滴定初始態(tài)鋅的總量所消耗的EDTA溶液體積，mL。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計[15-16]

本試驗將膠原蛋白多肽液質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定于3%的條件下，以螯合率為響應(yīng)值，選取肽鋅質(zhì)量比（X1）、時間（X2）、溫度（X3）、pH值（X4）為自變量，采取統(tǒng)計分析軟件建立4因素3水平的Box-Behnken模型，對魚皮膠原蛋白多肽與金屬離子螯合反應(yīng)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計。變量因素編碼及水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素編碼及水平Table 1 Factors and levels of response surface design

1.3.4 膠原蛋白多肽鋅螯合物的紫外光譜掃描分析

分別對膠原蛋白多肽螯合鋅、膠原蛋白多肽溶液和硫酸鋅溶液進(jìn)行紫外全波長掃描，通過比較三者之間最大吸收波長是否發(fā)生位移或者有新的吸收峰產(chǎn)生，間接來說明是否有新的物質(zhì)生成。

2 結(jié)果與分析

2.1 中心組合試驗設(shè)計結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理，每組試驗重復(fù)3次取其平均值，并采用統(tǒng)計分析軟件Design-Expert7.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，響應(yīng)面試驗參數(shù)設(shè)計與結(jié)果見表2。

對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合后，得到螯合率（Y）的回歸方程為：

表2 響應(yīng)面試驗參數(shù)設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design of technical parameter and results of response surface design

對回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

從表3螯合率回歸模型方差分析中顯著性檢驗結(jié)果可以看出，模型回歸p＜0.0001顯著，失擬項p＞0.05不顯著，該模型R2=0.9786，說明模型與實際試驗擬合程度較好。預(yù)測值與實測值之間存在較好的相關(guān)性，試驗誤差小，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于膠原蛋白多肽螯合鋅工藝實驗的分析和預(yù)測。另外，表3方差分析結(jié)果也表明，pH值、肽鋅質(zhì)量比和時間3個因素在試驗過程中均起主要作用，對方程影響顯著程度由大到小依次為pH值、肽鋅質(zhì)量比、時間和溫度，其中pH值和肽鋅質(zhì)量比對方程影響最為顯著，說明這二者直接關(guān)系螯合率的大小，而溫度的影響在一定范圍內(nèi)并不是很顯著。經(jīng)方差分析得：X4、X12、X32和X42項極顯著；X1、交互項X1X3對模型的影響較為顯著；X2、X22項對實驗的影響也達(dá)到了顯著水平，可知各因素之間不是簡單的線性關(guān)系，而是二次關(guān)系。

表3 螯合率回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model of chelating rate

2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

由Design-Expert7.0軟件處理中心設(shè)計實驗得到響應(yīng)面分析結(jié)果見圖1～6。圖1～圖6的極值點(diǎn)明顯，能夠直觀地看出試驗設(shè)計的各個因素及其相互間的交互作用對膠原蛋白多肽鋅螯合率的影響，便于參考比較。

圖1 肽鋅質(zhì)量比與時間互作用等高線和響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface and contour plots of interactions between peptide-zinc mass ratio and time

圖2、圖6表明，溫度對膠原蛋白多肽鋅螯合率的影響顯著性不大而肽鋅質(zhì)量比和pH值對螯合率的影響較為顯著。過高或過低的肽鋅質(zhì)量比和pH值都會使膠原蛋白多肽鋅螯合率降低，其中pH值的影響更為顯著，肽鋅質(zhì)量比和pH值存在一個最適值。圖1、圖3、圖5中等高線呈橢圓形，表示肽鋅質(zhì)量比、時間和pH值兩兩因素之間交互作用顯著。圖4表明時間和溫度對膠原蛋白多肽鋅螯合率的影響均不太顯著，與方差分析結(jié)果相吻合。

圖2 肽鋅質(zhì)量比與溫度互作用等高線和響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface and contour plots of interactions between peptide-zinc mass ratio and temperature

表3 肽鋅質(zhì)量比與pH互作用等高線和響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface and contour plots of interactions between peptide-zinc mass ratio and pH

圖4 時間與溫度互作用等高線和響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface and contour plots of interactions between time and temperature

圖5 時間與pH互作用等高線和響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface and contour plots of interactions between time and pH

圖6 溫度與pH互作用等高線和響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface and contour plots of interactions between temperature and pH

2.3 響應(yīng)面結(jié)果驗證性實驗

由模型方程計算可得，最佳螯合工藝條件為肽鋅質(zhì)量比2.8∶1，時間33.2min，溫度40.1℃，pH7.3，在此條件下螯合率為67.25%，與響應(yīng)面模型預(yù)測值67.36%極為接近。這說明該回歸模型能較好地反映膠原蛋白多肽螯合鋅生成量的變化規(guī)律，可以為實際操作提供良好的指導(dǎo)。

2.4 紫外掃描結(jié)果

圖7 硫酸鋅紫外掃描圖Fig.7 UV spectrum of zinc sulfate

圖8 膠原蛋白多肽紫外掃描圖Fig.8 UV spectrum of collagen peptide

圖9 膠原蛋白多肽螯合鋅紫外掃描圖Fig.9 UV spectrum of collagen peptide-zinc chelate

由圖7～圖9可以看出，膠原蛋白多肽螯合鋅的紫外掃描圖與膠原蛋白多肽和硫酸鋅的在吸光度強(qiáng)弱和位置上都有所不同，膠原肽螯合鋅樣品在波長379nm附近出現(xiàn)新的吸收峰，說明膠原蛋白多肽螯合鋅是一種新產(chǎn)生的物質(zhì)。

3 結(jié)論

本試驗以響應(yīng)面分析法對魚皮膠原蛋白多肽與金屬離子鋅的螯合工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，最佳螯合工藝條件為肽鋅質(zhì)量比2.8∶1，時間33.2min，溫度40.1℃，pH7.3。在此條件下螯合率為67.25%，與響應(yīng)面模型預(yù)測值67.36%非常接近，說明響應(yīng)面模型可以很好的應(yīng)用于膠原肽鋅螯合工藝條件的優(yōu)化。由紫外光譜分析初步可知，膠原蛋白多肽螯合鋅與膠原蛋白多肽和硫酸鋅的紫外掃描圖均不同，是一種新型螯合物。

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