染料木黃酮的抗巨噬細(xì)胞泡沫化效應(yīng) 及其分子機(jī)制研究

宋靜嵐，劉晨，趙穎，孟雅娟，路新華，趙寶華，鄭智慧，段寶玲

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，膽固醇、脂質(zhì)代謝異常以及炎癥的發(fā)生是 AS 的核心發(fā)病機(jī)制。在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程中，大量泡沫化巨噬細(xì)胞的堆積形成動脈血管脂質(zhì)條紋和脂質(zhì)斑塊，是 AS 病理學(xué)改變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。泡沫化細(xì)胞形成的主要原 因是由于巨噬細(xì)胞的膽固醇攝入過多，而膽固醇逆向轉(zhuǎn)運異常，從而造成細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的過度聚積。因此，降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，減少細(xì)胞中膽固醇酯的積蓄，從而減輕或抑制細(xì)胞的泡沫化，是防治 AS 的有效途徑。

過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators activated receptors，PPARs）是一種核受體超家族成員。大量的研究已經(jīng)證明 PPARs 參與體內(nèi)糖平衡、脂質(zhì)和脂蛋白代謝以及細(xì)胞分化過程，其激動劑具有胰島素增敏、抗炎作用以及抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展的重要調(diào)節(jié)作用[2-3]。肝 X 受體（liver X receptor，LXR）是一類在脂和膽固醇代謝中發(fā)揮重要作用的核受體[4]。在體內(nèi)，LXR 作為膽固醇感受器，通過被氧膽固醇類物質(zhì)[乳24(S),25-環(huán)氧化固醇、22(R)-羥基固醇和 24(S)-羥基固醇等]活化，對細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平變化作出應(yīng)答，調(diào)控多種參與膽固醇的吸收、外流、轉(zhuǎn)運和排泄等一系列基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)膽固醇的代謝和平衡。

染料木黃酮（5,7,4'-三羥基異黃酮，genistein）又稱染料木素、金雀異黃素，屬于異黃酮類化合物，是大豆異常黃酮中的一種主要活性因子，是大豆異黃酮產(chǎn)品中最有效的功能成分。染料木黃酮已經(jīng)被證明對人體具有調(diào)節(jié)血脂、降低膽固醇和防治動脈粥樣硬化作用[5-6]，但染料木黃酮在動脈粥樣硬化的發(fā)生早期事件中巨噬細(xì)胞泡沫化的作用以及其分子作用機(jī)制并沒有明確的結(jié)論和闡釋。為此，本研究對染料木黃酮的抗泡沫化效應(yīng)及其分子機(jī)制進(jìn)行了深入的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株與質(zhì)粒 中國倉鼠卵巢細(xì)胞 CHO- K1、小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7 購自上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。pGL3-GAL4、pGAL4-PPARα、pGAL4- PPARγ（LBD）、pGAL4-LXRα（LBD）、pGAL4-LXRβ、p3 × PPRE-Luc、pABCA1（promoter）-Luc、p4 × LXRE-Luc、pTARGET-PPARγ、pTARGET-LXRα 和 pTARGET-LXRβ 均由本實驗室構(gòu)建[7-8]。

1.1.2 主要試劑 Trizol RNA 提取試劑盒、SuperscriptTMReverse Transcription、脂質(zhì)體 2000 購于美國 Invitrogen 公司；胎牛血清、PRMI 1640 培養(yǎng)基、無酚紅 PRMI 1640 培養(yǎng)液為美國 Hyclone 公司產(chǎn)品；氧化的低密度脂蛋白 ox-LDL 購于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)所；LPS 購于美國 Sigma 公司；陽性藥 T0901317 為美國 Cayman 公司產(chǎn)品；染料木黃酮為華北制藥集團(tuán)新藥公司產(chǎn)品，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖 1。

圖1 染料木黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)式 Figure 1 Chemical structure of genistein

1.1.3 主要儀器 GeneAmp PCR System 9600 為美國 Backman 公司產(chǎn)品；ABI 7000 Real time PCR 儀購自美國ABI 公司；CO2培養(yǎng)箱為美國科峻儀器公司產(chǎn)品；Victor2 多標(biāo)計數(shù)儀為美國 PE 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞用含 10% 胎牛血清、 100 U/ml 青霉素和 100 mg/L 鏈霉素的 PRMI 1640 培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 油紅 O 染色觀察泡沫細(xì)胞 當(dāng) RAW264.7 細(xì)胞在 96 孔板中密度達(dá)到 90% 時，用無血清 PRMI 1640 培養(yǎng)液給細(xì)胞換液。加入終濃度為 50 μg/ml 的 ox-LDL 之后，分別用陽性藥 T0901317 和染料木黃酮處理 48 h 后進(jìn)行固定和油紅O 染色，并在顯微鏡下觀察和拍照。

1.2.3 瞬時轉(zhuǎn)染和報告基因檢測 具體方法參考文獻(xiàn)[8-9]，即將待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株以 3 × 104個/孔細(xì)胞數(shù)接種于 96 孔板，24 h 后將培養(yǎng)液換成含 10% 胎牛血清的無雙抗的 PRMI 1640 培養(yǎng)基，用 脂質(zhì)體 2000 轉(zhuǎn)染試劑將 0.3 μg/孔報告質(zhì)粒與 0.1 μg/孔表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中。6 h 后，加入測試樣品，DMSO 作為空白對照。加藥處理 24 h 后裂解細(xì)胞，利用 Victor2 多標(biāo)計數(shù)儀檢測熒光素酶的活性。藥物對核受體激動活性以熒光素酶的表達(dá)誘導(dǎo)倍增數(shù)表示，其為加藥組熒光素酶的活性與空白對照（DMSO）組的比值。半數(shù)有效濃度 EC50為最大效應(yīng)一半時的藥物濃度。

1.2.4 Real time PCR 檢測膽固醇逆轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達(dá) 當(dāng) RAW264.7 細(xì)胞在 6 孔板中密度達(dá)到 90% 時，加入染料木黃酮處理 24 h 后，用 Trizol 法提取細(xì)胞總 RNA，并反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。利用 ABI 7000 Real time PCR 儀以 GAPDH 基因為內(nèi)參基因，對 LXRα、LXRβ、ABCA1、ABCG1、SR-B1、CD36 等膽固醇代謝相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行實時定量 PCR 分析。

根據(jù) Real time PCR 引物設(shè)計原則，用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物，所有基因的引物見 表 1。Real time PCR 反應(yīng)條件：①預(yù)變性：95 ℃，1 min；②兩步法 PCR。變性：95 ℃，10 s；退火延伸：60 ℃，31 s；40 個循環(huán)。

表1 Real time PCR 所涉及的基因及其引物序列 Table 1 Genes and their primers used in Real time PCR

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 染料木黃酮對 ox-LDL 誘導(dǎo) RAW264.7 巨噬細(xì)胞泡沫化的抑制效應(yīng)

在小鼠 RAW264.7 細(xì)胞匯合度達(dá)到 90% 時加入終濃度為 50 μg/ml 的 ox-LDL，并且同時加入 20 μg/ml 染料木黃酮或等體積的 DMSO。48 h 后進(jìn)行油紅 O 染色，結(jié)果如圖2 所示，空白對照（DMSO）組 ox-LDL 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中出現(xiàn)大量 脂質(zhì)堆積（圖 2A），呈高泡沫化狀態(tài)。相比之下，經(jīng)過 20 μg/ml 染料木黃酮處理后（圖2B）的 RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)均沒有出現(xiàn)大量脂滴聚集的現(xiàn)象，細(xì)胞形態(tài)趨于正常，說明細(xì)胞的泡沫化被明顯抑制。

圖2 染料木黃酮對 RAW264.7 細(xì)胞泡沫化的抑制效應(yīng)（A：DMSO 組；B：10 μg/ml 染料木黃酮處理組） Figure 2 Inhibitory effect of genistein on macrophase foam cell formation (A: DMSO group； B: 10 μg/ml genistein treatment group)

2.2 染料木黃酮對核受體PPAR 的轉(zhuǎn)錄激動活性

2.2.1 染料木黃酮對 PPAR 嵌合表達(dá)報告基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性 將 pGL3-GAL4 報告質(zhì)粒分別與 pGAL4-PPARα（LBD）或 pGAL4-PPARγ（LBD）表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，6 h 后加入 0.1 ～ 50 μg/ml 不同濃度的染料木黃酮，孵育 24 h 后，進(jìn)行報告基因熒光素酶活性的檢測。結(jié)果見圖 3，從圖中可以看出染料木黃酮能劑量依賴地誘導(dǎo) PPARα 和 PPARγ 調(diào)控的熒光素酶的表達(dá)，其 EC50分別為 5.2 μg/ml 和 9.2 μg/ml。

2.2.2 染料木黃酮對 PPRE-Luc 報告基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性 為了證實染料木黃酮對 PPAR 的轉(zhuǎn)錄激動活性，進(jìn)一步利用 3 × PPRE-Luc 報告基因方法檢測染料木黃酮對 PPAR 轉(zhuǎn)錄激動活性。將報告質(zhì)粒 p3 × PPRE-Luc 和 PPARγ 全長的表達(dá)質(zhì)粒 pTarget-PPARγ 共轉(zhuǎn)染 CHO-K1 細(xì)胞，結(jié)果如圖 4 所示，染料木黃酮能劑量依賴地誘導(dǎo)報告基因熒光素酶的表達(dá)，其 EC50為 3.5 μg/ml。該結(jié)果與嵌合表達(dá)受體報告基因方法的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實了 染料木黃酮對 PPAR 的轉(zhuǎn)錄激動作用。

圖3 染料木黃酮對嵌合表達(dá) PPARα（A）和 PPARγ（B）的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性 Figure 3 Induction efficiency of genistein on the transactivion of PPAR in PPARα (A) and PPARγ (B) chimeric receptor assay

圖4 染料木黃酮對 PPRE-Luc 報告基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性 Figure 4 Induction efficiency of genistein on the transactivion of PPAR in PPRE-Luc receptor assay

2.3 染料木黃酮對 LXR 的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性

2.3.1 染料木黃酮對 LXR 嵌合受體報告基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性 將 pGL3-GAL4 與 pBIND-LXRα（LBD）或 pBIND-LXRβ（LBD）共轉(zhuǎn)染 CHO-K1 細(xì)胞，6 h 后加入 0.1 ～ 50 μg/ml 7 個不同濃度的染料木黃酮，并孵育 24 h。結(jié)果見圖 5，染料木黃酮上調(diào) LXRα 和 LXRβ 調(diào)控的熒光酶的表達(dá)成劑量 依賴關(guān)系，其 EC50分別為 1.6 μg/ml 和 3.3 μg/ml。

圖5 染料木黃酮對 LXRα（A）和 LXRβ（B）嵌合受體報告基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性 Figure 5 Induction efficiency of genistein on transactivion of LXR in LXRα (A) and LXRβ (B) chimeric receptor assay

2.3.2 染料木黃酮對 ABCA1-promoter-Luc 報告基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性 ABCA1 是 LXR 的一個重要靶基因，其啟動子序列中具有 LXR 的相應(yīng)元件 LXRE。為了進(jìn)一步證明染料木黃酮對 LXR 靶基因的轉(zhuǎn)錄激動效應(yīng)，檢測了其對 ABCA1-promoter- Luc 報告基因的誘導(dǎo)活性。共轉(zhuǎn)染報告質(zhì)粒 pGL3-ABCA1（promoter）-Luc 和全長 LXR 表達(dá)質(zhì)粒 pTARGET-LXR，加入 0.1 ～ 50 μg/ml 不同濃度的染料木黃酮 24 h 后，檢測熒光素酶的活性，結(jié)果如圖 6 所示，染料木黃酮能有效地誘導(dǎo) ABCA1 啟動子調(diào)控下的報告基因熒光素酶的表達(dá)，其 EC50約為 2.67 μg/ml。

2.3.3 染料木黃酮對 LXRE-Luc 報告基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性 LXRE-Luc 報告基因是一種被廣泛應(yīng)用于 LXR 調(diào)節(jié)劑轉(zhuǎn)錄激動活性測定的報告 基因方法。為了確認(rèn)染料木黃酮對 LXR 的轉(zhuǎn)錄 激動作用，本研究進(jìn)一步檢測了染料木黃酮對 LXRE-Luc 報告基因的轉(zhuǎn)錄激動活性。共轉(zhuǎn)染報告質(zhì)粒 p4 × LXRE-Luc 和 LXR 全長表達(dá)質(zhì)粒 pTARGET-LXR，6 h 后加入不同濃度的染料木黃酮。結(jié)果如圖 7 所示，報告基因熒光素酶的活性隨著染料木黃酮濃度的提高而劑量依賴地增加，EC50值為 2.8 μg/ml。

圖6 染料木黃酮對 ABCA1（promoter）-Luc 報告基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性 Figure 6 Induction efficiency of genistein on the transactivion of LXR in ABCA1(promoter)-Luc assay

2.4 染料木黃酮對巨噬細(xì)胞泡沫化相關(guān)基因表達(dá)的影響

為了研究染料木黃酮對巨噬細(xì)胞中與泡沫化密切相關(guān)基因的表達(dá)變化，利用實時定量 PCR 對 LXRα、LXRβ 以及巨噬細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運基因 ABCA1、ABCG1、CD36、SR-B1 等 6 個基因進(jìn)行了 mRNA 水平的變化分析。結(jié)果如圖 8 所示，相對于空白對照，經(jīng)染料木黃酮處理后的細(xì)胞中 ABCA1、ABCG1、LXRα、LXRβ、SR-B1 在 mRNA 水平的表達(dá)量被分別上調(diào)了（2.63 ± 0.18）、（15.9 ± 1.1）、（5.5 ± 0.23）、（5.9 ± 0.22）、（3.36 ± 0.15）倍，而 CD36 在 mRNA 水平的表達(dá)量下降為對照組的（0.79 ± 0.13）倍。

圖7 染料木黃酮對 LXRE-Luc 報告基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性 Figure 7 Induction efficiency of genistein on the transactivion of LXR in LXRE-Luc receptor assay

圖8 實時定量 PCR 分析染料木素對 RAW264.7 細(xì)胞中膽固醇轉(zhuǎn)運相關(guān)基因 LXRα、LXRβ、ABCA1、ABCG1、SR-B1 和 CD36 基因表達(dá)的影響 Figure 8 The relative mRNA levels of LXRα, LXRβ, ABCA1, ABCG1, SR-B1 and CD36 in RAW264.7 cells responsed to genistein

3 討論

動脈粥樣硬化（AS）是一個復(fù)雜的病理過程。泡沫細(xì)胞形成是動脈粥樣硬化形成的早期事件。在血管內(nèi)皮發(fā)生損傷的情況下，血液中的單核細(xì)胞通過內(nèi)皮間隙進(jìn)入血管內(nèi)皮內(nèi)膜，并增殖、分化為巨噬細(xì)胞。低密度脂蛋白滲入血管內(nèi)皮下并發(fā)生氧化修飾，形成氧化型低密度脂蛋白膽固醇，并主要通過巨噬細(xì)胞膜表面的 A 型清道受體吞噬大量氧化型低密度脂蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的大量堆積，形成泡沫細(xì)胞。越來越多的泡沫細(xì)胞堆積在一起形成脂質(zhì)條紋乃至脂質(zhì)斑塊。所以，巨噬細(xì)胞的泡沫化是動脈粥樣硬化形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而對巨噬細(xì)胞泡沫化過程的干預(yù)，可以起到防治 AS 的效果[1]。

巨噬細(xì)胞中有多種基因調(diào)控著細(xì)胞內(nèi)膽固醇的穩(wěn)態(tài)，其中主要包括清道夫受體和膽固醇轉(zhuǎn)運蛋白，如 ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白（ABCA1 和 ABCG1）和清道夫受體 B1（scavenger receptor B1，SR-B1）、CD36[1]。ABCA1 和 ABCG1 是巨噬細(xì)胞內(nèi)參與膽固醇外流信號通路的兩個關(guān)鍵基因，可介導(dǎo)膽固醇通過載脂蛋白 A-I（apoA-I）的活躍外流[9]。ABCA1/ ABCG1 表達(dá)的下調(diào)將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯蓄積和泡沫細(xì)胞的形成[10]。CD36 屬于 B 族清道夫受體家族成員之一，是巨噬細(xì)胞表面識別和內(nèi)吞氧化 LDL，從而導(dǎo)致動脈粥樣硬化巨噬細(xì)胞泡沫化的主要受體[11]。CD36 敲除能顯著降低小鼠腹膜巨噬細(xì)胞對 ox-LDL 的結(jié)合和攝取能力顯著降低以及動脈損傷程度[12]。SR-B1 是 B 族清道夫受體家族成員之一，是脂蛋白受體中唯一能真正介導(dǎo)細(xì)胞與 HDL-c 作用的膜受體。CLA1/ SR-B1 通過與 HDL 高親和力結(jié)合，促進(jìn)膽固醇從泡沫細(xì)胞外流，是重要的抗動脈粥樣硬化受體[13]。

大量的研究已經(jīng)證實 PPARγ 直接參與巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇和脂質(zhì)的平衡，進(jìn)而影響 AS 的進(jìn)程。PPAR 是調(diào)劑 CD36 表達(dá)的關(guān)鍵因子，PPARγ 的配體 15-脫氧前列腺素 J2（15d-PGJ2）和噻唑烷二酮類抗糖尿病藥物均能上調(diào) CD36 的表達(dá)，但由于 PPAR 同時對其他抗動脈粥樣硬化基因表達(dá)的調(diào)控，從而對抗了 CD36 表達(dá)上調(diào)帶來的影響[14]。PPAR 的激動可以上調(diào)肝 X 受體（LXR）的轉(zhuǎn)錄，而 LXR 的活化則誘導(dǎo) ABCA1、ABCG1、ABCG8 以及 SR-B1 等靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運，抑制巨噬細(xì)胞的泡沫化[14-15]。

本研究在體外 ox-LDL 誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞 RAW264.7 泡沫化實驗結(jié)果證明了染料木黃酮能有效地抑制巨噬細(xì)胞的泡沫化。多種報告基因方法證實染料木黃酮可以有效地激活 PPAR 和 LXR 轉(zhuǎn)錄功能，是一種 PPAR 和 LXR 雙效激動劑。這說明染料木黃酮是通過影響核受體 PPAR 和 LXR 的功能從而調(diào)節(jié)了膽固醇的轉(zhuǎn)運。進(jìn)一步的定量 PCR 結(jié)果說明染料木黃酮能夠明顯上調(diào) RAW264.7 巨噬細(xì)胞中膽固醇逆轉(zhuǎn)運基因 LXR、ABCA1、ABCG1 和SR-B1 的表達(dá)，增加細(xì)胞中膽固醇的外排，最終降低巨噬細(xì)胞中氧化膽固醇的含量，從而抑制巨噬細(xì)胞的泡沫化現(xiàn)象，該結(jié)果與Yang 等[16]研究黃酮類化合物可以上調(diào) CLA1/SR-B1 基因表達(dá)相一致。定量 PCR 的結(jié)果也顯示染料木黃酮對 CD36 基因的表達(dá)調(diào)控?zé)o明顯調(diào)節(jié)作用。該結(jié)果與 PPAR 激動劑可以誘導(dǎo) CD36 表達(dá)的實驗不相一致[13]，其可能的原因是染料木黃酮同時激活了 LXR 或其他基因，從而對抗了 PPAR 對 CD36 的上調(diào)效應(yīng)。

總之，本研究的實驗證實了染料木黃酮對動脈粥樣硬化中巨噬細(xì)胞泡沫化具有有效的抑制作用，而且該作用是由于染料木黃酮作為 PPAR 和LXR 雙激動劑，通過激活核受體 PPAR 和 LXR 轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑，從而誘導(dǎo) ATP 結(jié)合盒 A1（ABCA1）、G1（ABCG1）和SR-B1 的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞膽固醇流出，減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的蓄積，抑制泡沫化細(xì)胞形成。

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