細(xì)胞重編程及其在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用前景 ——寫在2012 年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)?lì)C布之際

周軍年，裴雪濤

2012 年 10 月 8 日，英國(guó)發(fā)育生物學(xué)家約翰·格登爵士（John B. Gurdon）和日本生物醫(yī)學(xué)家山中伸彌（Shinya Yamanaka）因“發(fā)現(xiàn)成熟細(xì)胞可以被重編程（reprogrammed）為多能性（pluripotency）”而獲獎(jiǎng)，這次獲獎(jiǎng)是在短短五年時(shí)間內(nèi)干細(xì)胞領(lǐng) 域的第二次獲獎(jiǎng)，上一次獲獎(jiǎng)是在 2007 年，馬 丁·埃文斯因 1981 年成功分離出小鼠胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）而與另外兩名從 事“基因打靶”（gene targeting）的科學(xué)家馬里 奧·卡佩基、奧利弗·史密斯共享諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

在 2006 年之前，通過體細(xì)胞重編程獲得多能干細(xì)胞的辦法有兩個(gè)，即核移植（nuclear transfer）和細(xì)胞融合（cell fusion）。而核移植領(lǐng)域正是由 1962 年約翰·格登的具有劃時(shí)代意義的實(shí)驗(yàn)所開 辟的，時(shí)年 29 歲的格登在完成博士學(xué)位時(shí)通過實(shí)驗(yàn)把蝌蚪分化細(xì)胞的細(xì)胞核移植進(jìn)入卵母細(xì)胞質(zhì)中，并培育出成體爪蟾，這是人類第一次從動(dòng)物的成體細(xì)胞中克隆出一個(gè)新的動(dòng)物，當(dāng) 1997 年多利羊誕生之后，這種克隆技術(shù)才被人們廣為所知。第一個(gè)進(jìn)行細(xì)胞核移植的科學(xué)家是德國(guó)的漢斯·斯 佩曼（Hans Spemann，1935 年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者），他在 1938 年時(shí)發(fā)現(xiàn)，把發(fā)育早期的蠑螈細(xì)胞核移植到去除了細(xì)胞核的發(fā)育晚期蠑螈胚胎中，胚胎細(xì)胞可以繼續(xù)發(fā)育成為一個(gè)完整的蠑螈。既然單獨(dú)的細(xì)胞核移植就可以讓生物由一個(gè)細(xì)胞逐漸分化發(fā)育為一個(gè)完整的個(gè)體，那么這種現(xiàn)象就一定不會(huì)局限于胚胎細(xì)胞中。成體細(xì)胞是否也可采用類似技術(shù)重新發(fā)育成一個(gè)完整個(gè)體？因?yàn)樵诋?dāng)時(shí)看來(lái)，胚胎細(xì)胞和成體細(xì)胞至少在基本結(jié)構(gòu)上沒有什么本質(zhì)性的區(qū)別，都是由細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)構(gòu)成的。毫無(wú)疑問，格登為這個(gè)問題提供了圓滿的答案。核移植技術(shù)具有非常好的臨床應(yīng)用前景，尤其是在制備患者特異性的細(xì)胞來(lái)源方面，這也是約翰·格登獲得諾貝爾獎(jiǎng)的重要原因。

既然核移植和細(xì)胞融合能夠使體細(xì)胞重編程，那么卵母細(xì)胞質(zhì)和 ESCs 中必然存在某些因子能賦予體細(xì)胞多能性。然而在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間里，科學(xué)家們一直認(rèn)為發(fā)育生物學(xué)上的“金科玉律”是不可打破的，即已經(jīng)分化了的細(xì)胞是不可能逆轉(zhuǎn)其發(fā)育生物學(xué)命運(yùn)的。1987 年，Davis 等[1]報(bào)道通過過表達(dá) MyoD，可以將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌細(xì)胞，這對(duì)后來(lái)的山中伸彌是一個(gè)很大的啟發(fā)，提示可以通過過表達(dá)特定的轉(zhuǎn)錄因子將體細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞?；诖送茰y(cè)，1999 年，在山中伸彌申請(qǐng)到奈良科學(xué)與技術(shù)學(xué)院助教授職位后即開始從事相關(guān)研究。在經(jīng)過 7 年的痛苦歷程后，終于從 24 個(gè)候選基因中篩到了 4 個(gè)與 ESCs 多能性密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子 Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4，即 Yamanaka 因子，結(jié)果顯示通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染這 4 個(gè)分子到小鼠成纖維細(xì)胞中，能夠獲得與 ESCs 特性基本相同的多能性干細(xì)胞系，將其稱為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells, iPS cells），該研究結(jié)果在 2006 年發(fā)表后引起了極大的轟動(dòng)[2]，隨后在 2007 年底，人 iPS 細(xì)胞同樣被三個(gè)不同的研究小組成功建立[3-5]。從第一次獲得小鼠胚胎干細(xì)胞[6]到 1998 年 Thomson 第一次獲得人類胚胎干細(xì)胞[7]，經(jīng)歷了 17 年，然而在這次里程碑式的發(fā)現(xiàn)浪潮中，科學(xué)家們用了很短的時(shí)間即實(shí)現(xiàn)了從小鼠 iPS 細(xì)胞到人 iPS 細(xì)胞的飛越。

但此前已有的關(guān)于 iPS 的研究，無(wú)一例外地采用了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將特定組合的編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因?qū)塍w細(xì)胞，存在潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)，這是人們最為擔(dān)心的問題之一，也是 iPS 技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室推向臨床應(yīng)用所面臨的巨大障礙，因此在后續(xù)的以應(yīng)用為目的的研究過程中，研究者主要是緊緊圍繞兩個(gè)問題展開研究，即“安全性”和“有效性”，其中，以“安全性”為主，兼顧“有效性”，因而在重編程方法上進(jìn)行了很多卓有成效的改進(jìn)和研究（表 1）。

表1 重編程方法總結(jié)和比較[8]

表2 重編程中使用的激活因子及靶標(biāo)[8]

除了轉(zhuǎn)染方法和手段的改進(jìn)，在重編程因子上也實(shí)現(xiàn)了去除 c-Myc 的因子組合[9]，并篩選了新的因子組合如 Oct4、Nanog、Sox2、Lin28[10]等，大大提高了 iPS 的安全性，但與此同時(shí) iPS 產(chǎn)生效率也大大下降，因此研究者們根據(jù)重編程機(jī)制的研究篩選了一系列可以提高重編程效率的激活因子，包括小分子化合物、特異性 miRNAs、RNA 干涉策略等（表 2），尤其是小分子化合物大大加速了未來(lái)潛在的臨床應(yīng)用，而避開了繁瑣的遺傳轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的緩慢的重編程過程。

在 iPS 起源的種子細(xì)胞上，目前為止已經(jīng)成功地從成纖維細(xì)胞[2-5]、B 淋巴細(xì)胞[11]、T 淋巴細(xì) 胞[12]、胰腺細(xì)胞[13]、胃細(xì)胞[14]、肝細(xì)胞[14]、甚至腫瘤細(xì)胞[15]等幾乎所有類型的成體細(xì)胞獲得了 iPS 細(xì)胞。

與核移植不同的是，與已分化細(xì)胞相比，成體干/祖細(xì)胞更容易被重編程為 iPS。如 Hochedlinger 實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，造血干/祖細(xì)胞形成 iPS 的效率是終末分化的 B 細(xì)胞和 T 細(xì)胞的 300 多倍，形成率超過 28%[16]。而采用人臍血來(lái)源的 CD133+ 造血干/祖細(xì)胞，只需要 Sox2 和 Oct4 兩個(gè)因子即可獲得 iPS 細(xì)胞[17]。Kim 等[18]發(fā)現(xiàn)，僅需要兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子 Oct4 和 Klf4 就足以誘導(dǎo)成年小鼠神經(jīng)干細(xì)胞獲得 iPS 細(xì)胞。此外，George Daley 實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)相比于皮膚細(xì)胞生成的 iPS 細(xì)胞，利用血細(xì)胞生成的 iPS 細(xì)胞更容易重新分化為血細(xì)胞，iPS 細(xì)胞的這種特性被稱為“表觀遺傳記憶”（epigenetic memory）[19]。上述發(fā)現(xiàn)對(duì)于高效率獲得 iPS 細(xì)胞或者高效誘導(dǎo) iPS 細(xì)胞獲得目的細(xì)胞具有重要的指導(dǎo)意義和應(yīng)用價(jià)值。

目前，利用 iPS 分化來(lái)源的造血細(xì)胞[20]、神經(jīng)細(xì)胞[21]、肝細(xì)胞[22]、心肌細(xì)胞[23]等在動(dòng)物模型上進(jìn)行相關(guān)疾病的治療也已獲得成功，從而表明其在體內(nèi)具有良好的多向分化潛能。此外，目前可以通過 iPS 技術(shù)將患者的體細(xì)胞重編程為 iPS 細(xì)胞，用來(lái)研究疾病的發(fā)生機(jī)制或進(jìn)行相關(guān)藥物的篩 選[24]。iPS 的成功還意味著可以不用卵子或胚胎就能得到與胚胎干細(xì)胞系具有相似分化潛能，同時(shí)又可能獲得與患者具有相同免疫配型的特異性的多能干細(xì)胞系，該項(xiàng)里程碑式的研究將有可能開啟未來(lái)個(gè)體化治療的發(fā)展之路。日本神戶的科學(xué)家已經(jīng)向政府申請(qǐng)開展世界上第一例 iPS 人體試驗(yàn)——利用患者自身來(lái)源的 iPS 細(xì)胞治療視網(wǎng)膜疾病，如果治療申請(qǐng)被批準(zhǔn)，將是 iPS 細(xì)胞技術(shù)的世界首例臨床應(yīng)用。血液系統(tǒng)雖然目前還沒有進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)的報(bào)道，但其在 iPS 細(xì)胞應(yīng)用方面的優(yōu)勢(shì)顯而易見，由于血液細(xì)胞產(chǎn)品（紅細(xì)胞、血小板）的無(wú)細(xì)胞核特性，使得 iPS 細(xì)胞基因組中一些潛在的危 險(xiǎn)因素在分化獲得的目的細(xì)胞中降至最低。同時(shí)，也使得進(jìn)行血液患者來(lái)源的 iPS 細(xì)胞的基因糾正 （gene correction）成為目前較為安全的潛在應(yīng)用之一[25-26]。

同樣，我國(guó)在細(xì)胞重編程領(lǐng)域也取得了令人矚目的成就，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2011 年，中國(guó)在細(xì)胞重編程和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞領(lǐng)域發(fā)表的論文數(shù)量已位居世界第三位。我國(guó)中科院動(dòng)物所周琪、上海交大曾凡一和北京生命科學(xué)研究所高紹榮等研究團(tuán)隊(duì)，于 2009 年分別利用 iPS 細(xì)胞克隆出小鼠，從而在世界上首次證明了 iPS 細(xì)胞的全能性[27-28]。在細(xì)胞重編程的機(jī)制研究領(lǐng)域，中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院裴端卿等在 Cell Stem Cell 上報(bào)道了間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)換對(duì)重編程的發(fā)生是必需的[29]。

而在個(gè)體化治療尚未真正啟動(dòng)之前，目前具有臨床應(yīng)用價(jià)值的一個(gè)工作是建立符合臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的人 iPS 細(xì)胞庫(kù)。iPS 細(xì)胞儲(chǔ)存計(jì)劃是山中伸彌一直倡導(dǎo)的，該計(jì)劃于 2012 年 7 月獲得了日本衛(wèi)生部委員會(huì)的支持，批準(zhǔn)其利用來(lái)自日本全國(guó)保存的數(shù)千份胎兒臍帶血樣本建立一個(gè)細(xì)胞系庫(kù)。山中伸彌計(jì)劃到 2020 年建立一個(gè)包含 75 種 iPS 細(xì)胞系的標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)，從而匹配日本 80% 的人口。

之所以將細(xì)胞重編程技術(shù)視為再生醫(yī)學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)和重要突破，是因?yàn)樗鼮槎嗄芨杉?xì)胞獲得提供了新的途徑。此前實(shí)驗(yàn)室研究的干細(xì)胞主要來(lái)源為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞，前者雖具有多向分化潛能，但因倫理、技術(shù)、資源、免疫、致瘤等問題使其研究和應(yīng)用受到限制；而后者雖然較易獲得，但其分化效率、組織整合等并不理想。綜合而言，誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞則集合了兩者的優(yōu)點(diǎn)，淡化了兩者的缺點(diǎn)：來(lái)源為成熟細(xì)胞，獲得相對(duì)廣泛、數(shù)量充足；通過細(xì)胞重編程，可使其獲得多向分化潛能；可以來(lái)源于患者自體，因此免除了倫理和免疫排斥等問題的困擾。

總之，iPS 細(xì)胞在其誕生的短短 6 個(gè)年頭里，發(fā)展勢(shì)頭迅猛，雖然目前在應(yīng)用的道路上還存在著眾多問題，但來(lái)自不同國(guó)家的眾多科學(xué)家們?cè)诳焖俣行У亟鉀Q著一個(gè)又一個(gè)束縛其潛在臨床應(yīng)用的問題，為其在不久的將來(lái)進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)?zāi)酥僚R床應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的科學(xué)基礎(chǔ)，體細(xì)胞重編程諾貝爾獎(jiǎng)的授予必將進(jìn)一步加快這種應(yīng)用基礎(chǔ)研究的步伐。

[1] Davis RL, Weintraub H, Lassar AB. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell, 1987, 51(6):987-1000.

[2] Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006, 126(4):663-676.

[3] Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell, 2007, 131(5):861-872.

[4] Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science, 2007, 318(5858): 1917-1920.

[5] Park IH, Zhao R, West JA, et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature, 2008, 451(7175): 141-146.

[6] Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature, 1981, 292(5819):154-156.

[7] Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science, 1998, 282(5391):1145- 1147.

[8] Mali P, Cheng L. Concise review: Human cell engineering: cellular reprogramming and genome editing. Stem Cells, 2012, 30(1):75-81.

[9] Okita K, Nakagawa M, Hyenjong H, et al. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science, 2008, 322(5903):949-953.

[10] Haase A, Olmer R, Schwanke K, et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell, 2009, 5(4):434-441.

[11] Hanna J, Markoulaki S, Schorderet P, et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell, 2008, 133(2):250-264.

[12] Loh YH, Hartung O, Li H, et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell, 2010, 7(1):15-19.

[13] Stadtfeld M, Brennand K, Hochedlinger K. Reprogramming of pancreatic beta cells into induced pluripotent stem cells. Curr Biol, 2008, 18(12):890-894.

[14] Aoi T, Yae K, Nakagawa M, et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science, 2008, 321(5889): 699-702.

[15] Carette JE, Pruszak J, Varadarajan M, et al. Generation of iPSCs from cultured human malignant cells. Blood, 2010, 115(20):4039-4042.

[16] Eminli S, Foudi A, Stadtfeld M, et al. Differentiation stage determines potential of hematopoietic cells for reprogramming into induced pluripotent stem cells. Nat Genet, 2009, 41(9):968-976.

[17] Giorgetti A, Montserrat N, Aasen T, et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood using OCT4 and SOX2. Cell Stem Cell, 2009, 5(4):353-357.

[18] Kim JB, Zaehres H, Wu G, et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature, 2008, 454(7204):646-650.

[19] Kim K, Doi A, Wen B, et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature, 2010, 467(7313):285-290.

[20] Park SW, Jun Koh Y, Jeon J, et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into functional CD34+ progenitor cells by combined modulation of the MEK/ERK and BMP4 signaling pathways. Blood, 2010, 116(25):5762-5772.

[21] Chambers SM, Fasano CA, Papapetrou EP, et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol, 2009, 27(2):275-280.

[22] Takayama K, Inamura M, Kawabata K, et al. Generation of metabolically functioning hepatocytes from human pluripotent stem cells by FOXA2 and HNF1α transduction. J Hepatol, 2012, 57(3):628- 636.

[23] Mummery CL, Zhang J, Ng ES, et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res, 2012, 111(3):344-358.

[24] Ye Z, Zhan H, Mali P, et al. Human-induced pluripotent stem cells from blood cells of healthy donors and patients with acquired blood disorders. Blood, 2009, 114(27):5473-5480.

[25] Zou J, Mali P, Huang X, et al. Site-specific gene correction of a point mutation in human iPS cells derived from an adult patient with sickle cell disease. Blood, 2011, 118(17):4599-4608.

[26] Raya A, Rodríguez-Pizà I, Guenechea G, et al. Disease-corrected haematopoietic progenitors from Fanconi anaemia induced pluripotent stem cells. Nature, 2009, 460(7251):53-59.

[27] Zhao XY, Li W, Lv Z, et al. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. Nature, 2009, 461(7260):86-90.

[28] Kang L, Wang J, Zhang Y, et al. iPS cells can support full-term development of tetraploid blastocyst-complemented embryos. Cell Stem Cell, 2009, 5(2):135-138.

[29] Li R, Liang J, Ni S, et al. A mesenchymal-to-epithelial transition initiates and is required for the nuclear reprogramming of mouse fibroblasts. Cell Stem Cell, 2010, 7(1):51-63.