雷帕霉素對(duì)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α誘導(dǎo)的內(nèi)皮生長(zhǎng)暈細(xì)胞增殖及黏附能力的影響

蔡雪黎 葉盛 周希 黃周青 張懷勤 黃偉劍

雷帕霉素對(duì)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α誘導(dǎo)的內(nèi)皮生長(zhǎng)暈細(xì)胞增殖及黏附能力的影響

蔡雪黎 葉盛 周希 黃周青 張懷勤 黃偉劍

目的 探討雷帕霉素對(duì)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（SDF-1α）誘導(dǎo)的內(nèi)皮生長(zhǎng)暈細(xì)胞（EOCs）增殖及黏附能力的影響。方法使用密度梯度離心法分離臍血單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)并擴(kuò)增EOCs，然后用免疫組化法、熒光染色法鑒定其內(nèi)皮細(xì)胞特性。分為空白對(duì)照組、10ng/ml SDF-1α處理組、10ng/ml SDF-1α及10ng/ml雷帕霉素共同干預(yù)組、10ng/ml雷帕霉素處理組，各處理組與EOCs作用24h，CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，并在倒置顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞的黏附能力。結(jié)果采用貼壁法培養(yǎng)的EOCs具有多種內(nèi)皮細(xì)胞特性。10ng/ml的SDF-1α能顯著提高EOCs的增殖及黏附能力（P＜0.05），而10 ng/ml的雷帕霉素能阻斷SDF-1α對(duì)EOCs增殖、黏附能力的促進(jìn)作用（P＜0.05）。結(jié)論雷帕霉素可抑制SDF-1α誘導(dǎo)的EOCs增殖及黏附。

雷帕霉素 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α 內(nèi)皮生長(zhǎng)暈細(xì)胞 再內(nèi)皮化 血管狹窄

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the effects of rapamycin on SDF-1α induced proliferation and adhesion of endothelial outgrowth cell(EOCs).MethodsThe mononuclear cells were harvested from umbilical cord blood by Ficoll density gradient centrifugation,which were then induced into EOCs and expanded in vitro.The endothelial characteristics of EOCs were identified by immunostaining and fluorescent staining.The EOCs were divided into 4 groups:control group,SDF-1α(10ng/ml) treatment group,rapamicin(10 ng/ml)treatment group and SDF-1α+rapamicin treatment group,the treatment in each group lasted for 24h.Proliferation of EOCs was evaluated by CCK8 and adhesion ability was measured under the inverted microscopy by counting adherent cells after cell replacing.ResultsEOCs presented endothelial characteristics.Immunostaining showed that surface antigens Factor VIII,CD34 and Flk-1 were positive;and fluorescent staining revealed that EOCs were bound to FITC-UEA-1 and uptook DiI-ac-LDL.After a 24h-incubation,SDF-1α (10 ng/ml)stimulated proliferation and adhesion activity of EOCs(P＜0.05),while the effects were inhibited by rapamycin at the concentration of 10 ng/mL(P＜0.05).ConclusionRapamycin inhibits SDF-1α induced proliferation and adhesion of endothelial outgrowth cells.

近年來(lái)冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）發(fā)展迅速。其中雷帕霉素藥物洗脫支架是臨床應(yīng)用最為廣泛的支架之一，緩慢洗脫的雷帕霉素能抑制平滑肌細(xì)胞遷移、增殖和胞外基質(zhì)的合成，從而抑制血管內(nèi)膜增厚，使冠心病患者獲益[1]。

內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）主要分為兩種類型[2-3]，即早期EPCs和晚期EPCs或稱內(nèi)皮生長(zhǎng)暈細(xì)胞（EOCs）。EOCs于2000年由Lin等[2]首先從人外周血中分離出來(lái)，具有高度增殖潛能及成血管能力，參與損傷血管內(nèi)皮的修復(fù)，對(duì)預(yù)防PCI術(shù)后再狹窄具有重要意義。研究表明雷帕霉素在抑制平滑肌細(xì)胞增生的同時(shí)也降低了EPCs的活性，從而抑制了PCI術(shù)后損傷內(nèi)皮的修復(fù)，導(dǎo)致術(shù)后血栓形成和內(nèi)膜增生[4]?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（SDF-1α）/CXCR4軸在介導(dǎo)EPCs歸巢到缺血組織參與血管新生具有重要的作用。研究顯示[5]，血管受損后，血管壁促炎及促黏附基因表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而使與之相關(guān)的趨化因子如VEGF、SDF-1α等產(chǎn)生增多，高表達(dá)的趨化因子介導(dǎo)EPCs向缺血區(qū)募集，而雷帕霉素可能會(huì)降低這個(gè)募集作用。本研究旨在闡明雷帕霉素對(duì)SDF-1α誘導(dǎo)的EOCs增殖、黏附能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 收集2010-05—2011-02溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科棄用的健康產(chǎn)婦的新鮮胎盤臍帶血30例，每次采血量約30ml。EGM-2培養(yǎng)基購(gòu)自瑞士Lonza公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，人纖維連接蛋白購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司，異硫氰基熒光素標(biāo)記荊豆凝集素玉（FITC-UEA-玉）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Dil標(biāo)記的乙?；疞DL（DiI-ac-LDL）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，ⅤⅢ因子抗體、CD34抗體、Flk-1抗體購(gòu)自武漢Boster公司，CCK8試劑購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所中國(guó)（上海）代表處。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分離培養(yǎng) 參照Ingram等[6]、林以諾等[7]方法，采用密度梯度離心法收集臍血中的單個(gè)核細(xì)胞，重懸于2ml含10%胎牛血清的EGM-2培養(yǎng)液中，接種在人纖維連接蛋白預(yù)包被的6孔板的一個(gè)孔上。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，用PBS輕柔洗去未貼壁細(xì)胞并更換新鮮培養(yǎng)液。此后7d內(nèi)每天更換一半培養(yǎng)液，7d后每3d更換全部培養(yǎng)液，待原代細(xì)胞生長(zhǎng)匯合約80%后傳代進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 免疫細(xì)胞染色法 取第2代細(xì)胞接種至24孔板中,培養(yǎng)至貼壁。采用40g/L多聚甲醛固定20min，0.3% H2O2-甲醇液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10min，PBS浸洗后分別加1∶100稀釋的玉抗小鼠抗flk-1mAb，兔ⅤⅢ因子相關(guān)抗原抗體及兔抗CD34抗體，于4℃下孵育過(guò)夜。Ⅱ抗結(jié)合參照ABC免疫組化檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，之后用AEC染色試劑染色,蘇木素復(fù)染,在倒置相差顯微鏡下（×200）觀察染色結(jié)果。

1.2.3 細(xì)胞熒光染色 在上述細(xì)胞中加入DiI-ac-LDL（10mg/L）37℃孵育4h，用4%多聚甲醛固定10min，PBS浸洗后將FITC-UEA-玉（10mg/L）加于上述標(biāo)本37℃孵育1h。采用熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果DiI-ac-LDL和FITC-UEA-玉雙染色陽(yáng)性細(xì)胞為正在分化的EPCs。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組 取第2代細(xì)胞分成4組：（1）對(duì)照組：加入配制雷帕霉素的溶劑（0.1%DMSO）；（2）SDF-1α干預(yù)組：加入10ng/ml SDF-1α；（3）雷帕霉素和SDF-1α共同干預(yù)組：加入10ng/ml SDF-1α及10 ng/ml雷帕霉素；（4）雷帕霉素干預(yù)組：加入10ng/ml雷帕霉素。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。

1.2.5 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 第2代細(xì)胞生長(zhǎng)至融合，0.05%胰蛋白酶消化收集貼壁細(xì)胞,重懸后計(jì)數(shù)，以1× 104個(gè)/孔接種到96孔培養(yǎng)板，24h后更換無(wú)血清的培養(yǎng)基同步24h，然后分為以上4組進(jìn)行處理，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，24h后更換新鮮培養(yǎng)液，每孔加入10μlCCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑，于37℃孵育2.5h，酶標(biāo)儀450nm下讀取吸光度OD值。

1.2.6 黏附能力測(cè)定 第2代細(xì)胞生長(zhǎng)至融合，0.05%胰蛋白酶消化收集貼壁細(xì)胞,重懸后計(jì)數(shù)，以相同細(xì)胞數(shù)接種到24孔培養(yǎng)板,24h后更換無(wú)血清的培養(yǎng)基同步24h，然后分為以上4組進(jìn)行處理，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，24h后消化收集各組貼壁細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，將相同細(xì)胞數(shù)的EOCs接種到96孔板，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min后，用Hanks液輕柔洗去各孔未貼壁細(xì)胞,倒置相差顯微鏡下隨機(jī)取10個(gè)視野（×400）計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示,組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者采用DunnettT3檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 EOCs的鑒定 采用密度梯度離心法分離獲得的單個(gè)核細(xì)胞在培養(yǎng)約第4～6天開(kāi)始出現(xiàn)梭形細(xì)胞，第7～9天形成若干個(gè)細(xì)胞集落，細(xì)胞呈橢圓形鋪路石樣排列（圖1，見(jiàn)插頁(yè)）。免疫組化染色顯示：培養(yǎng)16～21d的EOCs表面CD34、Flk-1、ⅤⅢ因子相關(guān)抗原表達(dá)均為陽(yáng)性（圖2，見(jiàn)插頁(yè)）。采用DiI-ac-LDL和FITC-UEA-玉熒光染色后于熒光顯微鏡觀察,雙染色陽(yáng)性細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EOCs（圖3，見(jiàn)插頁(yè)）。

2.2細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 與對(duì)照組相比，10ng/ml的SDF-1α能顯著提高EOCs的增殖能力（P＜0.05），而10ng/ml的雷帕霉素能阻斷SDF-1α對(duì)EOCs增殖能力的促進(jìn)作用（P＜0.05）。雷帕霉素10ng/ml單獨(dú)作用對(duì)EOCs的增殖雖有抑制，但與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表1。

2.3 細(xì)胞黏附能力檢測(cè) 與對(duì)照組相比，10 ng/ml的SDF-1α能顯著提高EOCs的黏附能力（P＜0.05），同時(shí)這種促進(jìn)作用能被10ng/ml的雷帕霉素阻斷（P＜0.05）。而雷帕霉素10 ng/ml單獨(dú)作用對(duì)EOCs的黏附能力雖有抑制，但與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表1。

3 討論

血管內(nèi)皮的損傷是冠心病發(fā)生、發(fā)展的始動(dòng)因素。現(xiàn)今針對(duì)冠心病的治療主要有藥物治療、PCI以及冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)，使閉塞的血管再通，增加血液灌注，但無(wú)法使受損的血管內(nèi)皮再生。因此人們期待尋找一種能夠使血管再生的方法，以EPCs移植為基礎(chǔ)的細(xì)胞療法日益引起了人們的關(guān)注。EPCs由Asahara[8]首次自成人外周血分離獲得，從而使人們對(duì)血管再生有了新的認(rèn)識(shí)，即成人血管再生亦可由EPCs分化而來(lái)。EPCs是一類能夠遷移、增殖,并分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,其參與人胚胎血管生成以及出生后血管新生和內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過(guò)程。

表1 雷帕霉素對(duì)SDF-1α介導(dǎo)的EOCs增殖和黏附能力的影響

SDF-1/CXCR4軸是介導(dǎo)造血干細(xì)胞歸巢到骨髓并恢復(fù)造血功能最重要的因素。在EPCs移植治療缺血性心肌病的研究中發(fā)現(xiàn)，缺血組織SDF-1表達(dá)的上調(diào)能介導(dǎo)EPCs歸巢到缺血組織參與新生血管的形成?？梢?jiàn)SDF-1與血管EPCs在干/祖細(xì)胞移植方面關(guān)系密切。

雷帕霉素藥物洗脫支架是臨床應(yīng)用最為廣泛的藥物洗脫支架之一。緩慢洗脫的雷帕霉素可以抑制血管中膜平滑肌細(xì)胞的增生，使其細(xì)胞周期停滯在G1/S期，從而減少了內(nèi)膜的增厚。同時(shí)大量研究表明雷帕霉素在抑制血管平滑肌細(xì)胞的同時(shí)也抑制了EPCs的活性[9-12]，使損傷血管的再內(nèi)皮化過(guò)程受抑制，血管完整性遭到破壞，局部的炎癥反應(yīng)使得血栓形成增加，并且促進(jìn)血管中層平滑肌細(xì)胞的反應(yīng)性增生，使得內(nèi)膜增厚，血管再狹窄率增加。由此可見(jiàn)，雷帕霉素藥物洗脫支架在PCI中的應(yīng)用是一把雙刃劍。如何使得這把雙刃劍減弱或消除其不利的一面，只向著有利于臨床診療方向發(fā)展，是臨床亟待解決的問(wèn)題。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素會(huì)阻斷SDF-1α誘導(dǎo)的EOCs增殖和遷移能力，從而抑制缺血組織SDF-1表達(dá)上調(diào)介導(dǎo)的EPCs歸巢到缺血組織，這可能是雷帕霉素抑制血管內(nèi)支架置入術(shù)后內(nèi)皮修復(fù)及導(dǎo)致遲發(fā)性支架內(nèi)血栓形成的機(jī)制之一。而對(duì)雷帕霉素阻斷SDF-1誘導(dǎo)的EOCs增殖和遷移能力中所涉及的具體機(jī)制，目前我們還在進(jìn)一步的探索當(dāng)中。

[1] Patel S D,Waltham M,Wadoodi A,et al.The role of endothelial cells and their progenitors in intimal hyperplasia[J].Ther Adv Cardiovasc Dis,2010,4(2):129-141.

[2] Lin Y,Weisdorf D J,Solovey A,et al.Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood[J].Clin Invest, 2000,105(1):71-77.

[3]Jin Hur,Chang-Hwan Yoon,Hyo-Soo Kim,et al.Characterization of Two Types of Endothelial Progenitor Cells and Their DifferentContributionstoNeovasculogenesis[J].Arterioscler.Thromb. Vasc.Biol.,2004,24(2):288-293.

[4] Luscher T F,Steffel J,Eberli F R,et al.Drug-eluting stent and coronary thrombosis:biological mechanisms and clinical implications[J].Circulation,2007,115(8):1051-1058.

[5] Thomas G.Nührenberg,Rainer Voisard,Felicitas Fahlisch,et al. Rapamycin attenuates vascular wall inflammation and progenitor cell promoters after angioplasty[J].The FASEB Journal,2005,18 (14):246-248.

[6] Ingram D A,Mead L E,Tanaka H,et al.Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood[J].Blood,2004,104(9):2752-2760.

[7] 林以諾,張懷勤,虞慧君,等.羅格列酮對(duì)ADMA氧化應(yīng)激損傷內(nèi)皮生長(zhǎng)暈細(xì)胞的影響[J].中國(guó)病理生理雜志,2008,24(11):2126-2131.

[8] Asahara T,Murohara T,Sullivan A,et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Science,1997, 275(5302):964-967.

[9]Miriuka S G,Rao V,Peterson M,et al.mTOR Inhibition Induces Endothelial Progenitor Cell Death[J].Am J Transplant,2006,6(9): 2069-2079.

[10] Butzal M,Loges S,Schweizer M,et al.Rapamycin inhibits proliferation and differentiation of human endothelial progenitor cells in vitro[J].Exp Cell Res,2004,300(1):65-71.

[11] Chen T G,Chen J Z,Wang X X.Effects of rapamycin on number activity and eNOS of endothelial progenitor cells from peripheral blood[J].Cell Prolif,2006，39(2):117-125.

[12] Fukuda D,Sata M,Tanaka K,et al.Potent Inhibitory Effect of Sirolimus on Circulating Vascular Progenitor Cells[J].Circulation，2005,111(7):926-931.

Rapamycin inhibits SDF-1α induced proliferation and adhesion of endothelial outgrowth cells

Rapamycine SDF-1α Endothelial outgrowth cellReendothelialization Angiostenosis

2012-11-06）

（本文編輯：馬雯娜）

溫州市科技局對(duì)外合作交流項(xiàng)目（H20100009）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科（蔡雪黎、周希、黃周青、張懷勤、黃偉劍）；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科（葉盛）