蒸餾水滅活胃癌術(shù)中用物攜帶腫瘤細(xì)胞的研究

喻曉芬 洪敏 張琴芳 胡弦琴 葉再元

蒸餾水滅活胃癌術(shù)中用物攜帶腫瘤細(xì)胞的研究

喻曉芬 洪敏 張琴芳 胡弦琴 葉再元

胃癌在我國的發(fā)病率及病死率均較高，胃癌根治術(shù)是治療胃癌最直接有效的方法，只要患者條件允許又無明顯遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，均應(yīng)爭取根治性切除，但手術(shù)操作往往會增加腫瘤細(xì)胞醫(yī)源性播散的概率[1]。醫(yī)源性播散是腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的一個重要原因，術(shù)中用物如器械、敷料、手套、縫合器等，是術(shù)中切割、分離、結(jié)扎、止血的直接工具，隨時可能被脫落腫瘤細(xì)胞污染而成為攜帶者。有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤切除離體時器械的腫瘤細(xì)胞攜帶率為33.33%～46.67%，手術(shù)用物總體攜帶率為36.67%～90.00%[2]。本研究觀察蒸餾水對術(shù)中被腫瘤細(xì)胞污染的手術(shù)用物的滅瘤效果，為被污染的手術(shù)用物尋找一種便捷、有效的術(shù)中處理方法，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 胃癌標(biāo)本 選取2011-04—2012-02我院收治的無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌患者90例，其中男58例，女32例，男女比例1.8∶1；年齡42～74歲，平均（50.2±12.5）歲；腫瘤位于胃竇部43例，胃體部24例，胃底賁門部23例。術(shù)前電子胃鏡活組織病理切片提示：低分化腺癌58例，中分化腺癌24例，高分化腺癌8例；TNM分期：玉期10例，Ⅱ期34例，Ⅲ期46例；其中早期胃癌4例，進展期胃癌86例，均成功實施D2胃癌根治術(shù)。

1.1.2 儀器與試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco，美國）；胎牛血清（杭州四季青生物公司）；細(xì)胞培養(yǎng)皿（Corning，美國）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（BB15，德國）；恒溫水浴箱（DKB600B，中國）；蘇木素、伊紅（杭州捷程生物公司）；普通生物顯微鏡（CX31-12202，日本）；無菌蒸餾水（杭州民生藥業(yè)有限公司，批號：11012258）；無菌0.9%氯化鈉溶液（杭州民生藥業(yè)有限公司，批號：11012272）；直徑30cm的500ml干燥圓碗（高壓蒸汽滅菌后備用）。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤細(xì)胞收集 術(shù)中腫瘤離體后以備用器械更換可疑污染器械，并更換手套及敷料。將90例患者手術(shù)的術(shù)中用物均分為5組，A：手術(shù)器械（血管鉗8把、手術(shù)刀2把、剪刀2把、持針器2把、縫針4枚、拉鉤3把、腸鉗2把、有齒血管鉗2把），B：術(shù)者手套（主刀、一助、二助），C：洗手護士擦器械及回收殘線的紗條及手套，D：術(shù)中壓迫止血及清潔術(shù)野的紗條、紗墊，E：縫合器。從開腹至腫瘤切除離體時所使用的5組手術(shù)用物分別浸泡在5只裝有37℃500ml 0.9%氯化鈉溶液的圓碗內(nèi)，浸泡時手術(shù)用物必須完全浸沒，剪刀、血管鉗、持針器、腸鉗等有關(guān)節(jié)器械須打開關(guān)節(jié)，浸泡30s后用無菌刷刷洗器械。收集浸泡液低速離心，無菌條件下收集離心后沉淀的細(xì)胞，于含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，具體見[3]。HE染色后由2位資深病理科專家鏡下觀察，參照患者離體組織的病理切片確認(rèn)腫瘤細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞檢測 培養(yǎng)24h后將生長良好的腫瘤細(xì)胞進行爬片培養(yǎng)并分為兩組，A組為氯化鈉溶液對照組，B組為蒸餾水組，分別將爬片浸泡于37℃的滅菌蒸餾水或0.9%氯化鈉溶液中，每組再分為6小組，分別浸泡20、30、45、60、90和120s。收集爬片以95%乙醇固定后常規(guī)染色，中性樹膠封片后倒置顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞滅活效果。同樣依上述方法進行不同溫度45、50、55、60℃條件下浸泡并固定染色觀察。取滅瘤效果最好的1組重復(fù)試驗4次，細(xì)胞浸泡處理后更換含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，觀察腫瘤細(xì)胞的增殖能力。

1.2.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) HE片由資深病理專家在普通生物顯微鏡下觀察，每張玻片隨機觀察10個高倍視野（×400倍）。以細(xì)胞腫脹、胞膜破裂、核固縮和核碎裂為細(xì)胞壞死的形態(tài)學(xué)特征[4]。

1.2.4 細(xì)胞滅活率計算 單個標(biāo)本各時間點滅活率=（對照組每高倍視野下腫瘤細(xì)胞數(shù)-蒸餾水組每高倍視野下腫瘤細(xì)胞數(shù)）/對照組每高倍視野下腫瘤細(xì)胞數(shù)× 100%，每個標(biāo)本各時間段均計數(shù)3個高倍視野。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 不同溫度和浸泡時間對腫瘤細(xì)胞的滅活情況 術(shù)中共浸泡處理手術(shù)用物450次，其中69次培養(yǎng)出腫瘤細(xì)胞，檢出率15.30%（69/450）。55℃以下的溫度梯度（37、45、50℃）的蒸餾水浸泡20、30、45、60、90和120s后，腫瘤細(xì)胞沒有完全滅活。但相同溫度的蒸餾水中，隨著浸泡時間的延長，細(xì)胞滅活率逐漸增高；相同時間隨著浸泡溫度的升高，細(xì)胞滅活率也增高。37、45、50、55、60℃下不同浸泡時間的細(xì)胞滅活率均具有統(tǒng)計學(xué)差異（χ2= 54.01、113.89、65.51、111.63、147.23，均P＜0.01），見表1。

表1 蒸餾水組不同溫度和時間腫瘤細(xì)胞滅活率比較（%）

2.2 不同溫度和浸泡時間腫瘤細(xì)胞形態(tài)變化 在55℃的蒸餾水中浸泡60s后，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，胞膜消失，胞質(zhì)空泡化，細(xì)胞核體積縮小，核內(nèi)染色質(zhì)濃縮，部分染色質(zhì)分解，核淡染，部分未見細(xì)胞核，并見細(xì)胞脫落，滅活率達(dá)100%，見圖1B。而在55℃的0.9%氯化鈉溶液中浸泡60s后，僅有部分細(xì)胞發(fā)生類似改變，還有部分細(xì)胞僅是體積增大，胞質(zhì)略疏松，而細(xì)胞核形態(tài)無明顯改變，見圖1A。55℃蒸餾水浸泡60s后再培養(yǎng)24h，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞變圓、裂解，全部懸浮于培養(yǎng)液中，未見貼壁生長的有活性細(xì)胞。

圖1 腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（A：0.9%氯化鈉溶液浸泡；B：蒸餾水浸泡；HE染色，×400）

3 討論

惡性腫瘤的種植轉(zhuǎn)移與外科手術(shù)關(guān)系密切[5]，胃癌患者行根治術(shù)后，半數(shù)以上最終死于腹膜種植轉(zhuǎn)移[6]。腹腔內(nèi)脫落癌細(xì)胞（exfoliated cancer cells,ECC）的存在是形成腹膜種植轉(zhuǎn)移的先決條件，脫落癌細(xì)胞一方面來源于癌細(xì)胞浸透胃壁漿膜直接脫落到腹腔，另一方面由于手術(shù)時標(biāo)本切緣的癌細(xì)胞脫落[7]，手術(shù)操作中不必要的擠壓、牽拉，使更多的癌細(xì)胞逸出脫落，黏附到手術(shù)用物上，當(dāng)再次使用則會引起新的脫落種植，甚至?xí)纬蓴y帶、脫落種植鏈，增加癌細(xì)胞腹膜種植轉(zhuǎn)移的機會[8]。在本研究中，浸泡處理的手術(shù)用物中腫瘤細(xì)胞檢出率為15.30%，因此污染手術(shù)用物的腫瘤細(xì)胞滅活對于防止醫(yī)源性的腫瘤播散具有重要意義。1954年提出無瘤操作的概念，是指在惡性腫瘤的手術(shù)操作中為減少或防止腫瘤細(xì)胞的脫落、種植和播散而采取的一系列措施[9]。有研究證實，嚴(yán)格的無瘤技術(shù)可以防止癌細(xì)胞的醫(yī)源性播散[10]。目前，分組和更換器械是文獻(xiàn)報道中器械減瘤處理的常用方法[11]；但執(zhí)行有一定困難[12]，既增加手術(shù)成本和手術(shù)室護士的工作量，又影響手術(shù)進展而且增加器械遺漏在腔隙中的風(fēng)險。因此，尋找一種快速、便捷、有效的方法處理術(shù)中腫瘤細(xì)胞污染的器械對減少人為因素造成的腫瘤播散有著重要的意義。

目前，對腫瘤細(xì)胞物理殺傷方法主要有以下幾種：（1）利用滲透壓差的作用，使腫瘤細(xì)胞腫脹裂解，從而失去活性；（2）利用腫瘤細(xì)胞對高溫的敏感性明顯高于正常細(xì)胞的特性，采用熱處理的方式殺死腫瘤細(xì)胞；（3）紫外線照射造成細(xì)胞損傷，從而達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，但是這種方式在手術(shù)中可行性不大。結(jié)合滲透壓及熱療原理，筆者試圖進一步尋求快速，簡便、有效的腫瘤細(xì)胞滅活方法，從而避免術(shù)中腫瘤細(xì)胞的醫(yī)源性播散。

作為一種低滲液體，蒸餾水的滲透壓接近0，由于滲透壓的差異，可以使腫瘤細(xì)胞腫脹裂解，從而失去活性。徐李娟等[13]報道受腫瘤細(xì)胞污染的器械經(jīng)蒸餾水常溫浸泡5min后，沾染的腫瘤細(xì)胞可被全部滅活，器械可以重新使用。但是術(shù)中浸泡器械5min再使用，就會導(dǎo)致手術(shù)和麻醉時間延長，增加手術(shù)風(fēng)險；而且手術(shù)是一個連續(xù)過程，長時間等待會影響醫(yī)生對手術(shù)器械的選擇[14]，限制了這些方法在臨床上應(yīng)用。本研究利用蒸餾水的低滲透壓以及熱療對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，浸泡受腫瘤細(xì)胞污染的胃癌手術(shù)用物，促使腫瘤細(xì)胞自發(fā)破裂、溶解,從而達(dá)到滅活腫瘤細(xì)胞的目的。

本研究發(fā)現(xiàn)相同溫度的蒸餾水中，隨著浸泡時間的延長，細(xì)胞滅活率逐漸增高；而相同浸泡時間隨著溫度的升高，細(xì)胞滅活率也增高。經(jīng)55℃蒸餾水浸泡60s后，未見存活細(xì)胞；55℃蒸餾水浸泡60s后再培養(yǎng)24h，腫瘤細(xì)胞懸浮，失去增殖能力。同時調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)洗手護士戴著乳膠手套的手對55℃能忍受，長時間浸泡其中不會燙傷；另外調(diào)查了270位手術(shù)醫(yī)生，93.30%的醫(yī)生認(rèn)為術(shù)中等待器械浸泡60s可以接受。以此為依據(jù)，術(shù)中受腫瘤細(xì)胞污染的用物經(jīng)55℃蒸餾水浸泡60s后，可全部滅活黏附的腫瘤細(xì)胞，手術(shù)用物可以重新使用；既有效的預(yù)防了腫瘤細(xì)胞的種植和播散，又不會因為術(shù)中長時間浸泡影響手術(shù)進程，避免了術(shù)中頻繁更換用物，從而也可以減少手術(shù)成本。

綜上所述，胃癌手術(shù)中可疑污染器械在55℃蒸餾水中浸泡60s后，滅瘤效果好，作用時間短，有效防止腫瘤細(xì)胞的種植及播散，而且蒸餾水價格低廉容易獲取，可節(jié)省手術(shù)成本，為胃癌手術(shù)的無瘤操作提供了一種新途徑。

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（本文編輯：胥昀）

《浙江醫(yī)學(xué)》“病例討論”欄目征稿

根據(jù)廣大讀者的建議，本刊自2010年第7期起開辟“病例討論”欄目，論文結(jié)構(gòu)分為“病例摘要”和“討論”兩部分，以期通過對疑難、復(fù)雜或罕見病例的介紹和討論，交流臨床工作經(jīng)驗，幫助廣大臨床醫(yī)師掌握科學(xué)的臨床思維方式，提高各?？坪投鄬W(xué)科的綜合分析判斷能力，進而提高醫(yī)療水平?，F(xiàn)特向廣大臨床醫(yī)師征集相關(guān)病例，具體要求如下。

1病例選擇 （1）疑難病例，特別是涉及多學(xué)科、多領(lǐng)域的疑難病例；（2）診斷明確，但病情危重和（或）治療棘手的病例；（3）臨床較罕見的病例。以上病例均需最終獲得明確診斷或成功治療，且臨床資料齊全，并能提供實驗室、影像學(xué)和（或）病理確診依據(jù)。

2寫作格式和要求（1）病歷摘要：分段敘述患者的簡要病史（包括主訴、現(xiàn)病史、既往史等）、入院后體檢情況、輔助檢查結(jié)果、入院后治療方案及病情變化等內(nèi)容；（2）討論：分段記錄各級或各科或各院醫(yī)師對該病例的特點、診斷、鑒別診斷、進一步輔助檢查和治療方案等方面的分析，若為罕見病，則需介紹目前國內(nèi)外關(guān)于該病診治方面的最新進展；（3）列出相關(guān)的國內(nèi)外主要參考文獻(xiàn)；（4）全文字?jǐn)?shù)在3000字左右。

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本刊編輯部

2012-10-26）

浙江省衛(wèi)生廳基金資助項目（2013KYA011）

310014 杭州，浙江省人民醫(yī)院手術(shù)室（喻曉芬、洪敏、張琴芳、胡弦琴），胃腸外科（葉再元）

葉再元，E-mail:yxf4800@163.com