苦丁茶中酚酸類化合物的HPCE分離測(cè)定

李娟，檀華蓉，楊利新，王榮富*

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心，安徽合肥 230036；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥 230036）

苦丁茶中酚酸類化合物的HPCE分離測(cè)定

李娟1，檀華蓉1，楊利新2，王榮富1*

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心，安徽合肥 230036；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥 230036）

通過建立了高效毛細(xì)管電泳法同時(shí)分離測(cè)定苦丁茶中山奈酸、蘆丁、沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸、沒食子酸、原兒茶酸等7種酚酸類物質(zhì)含量的方法。對(duì)緩沖液離子濃度和pH、分離電壓和毛細(xì)管溫度等電泳分離條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在柱溫25℃、電壓20kV、20mmol/L pH7.5磷酸二氫鉀-硼砂緩沖液的電泳條件下，可在13min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了7種酚酸類物質(zhì)的分離檢測(cè)。本方法具有較高的靈敏度，呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，r為0.9982～0.9996，遷移時(shí)間重現(xiàn)性為0.1557%～0.1664%，峰面積重現(xiàn)性為1.080%～3.466%，回收率為80.14%～93.24%。本研究采用建立好的方法測(cè)定了不同產(chǎn)區(qū)苦丁茶中7種酚酸類化合物的含量。

毛細(xì)管電泳，苦丁茶，酚酸類物質(zhì)

中國茶葉加工 2013，（1）:43～47

苦丁茶（Ilex kudingchaC.J.Tseng）屬冬青科冬青屬植物，又稱瓜盧、皋盧等，是我國南方和東南亞地區(qū)人民常飲用的一類代用茶，也是傳統(tǒng)的藥用植物[1]。酚酸類化合物是高等植物中普遍存在的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有營養(yǎng)和抗氧化等藥理活性和藥用價(jià)值，如綠原酸具有利膽、抗菌、降壓、增高白血球及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理作用；沒食子酸則作為重要的有機(jī)精細(xì)化學(xué)品，廣泛用于有機(jī)合成、醫(yī)藥止血收斂劑、食品抗氧化劑、防腐劑、消毒劑、葡萄生長劑等；咖啡酸和阿魏酸則作為新的非肽類ET拈抗劑，可治療高血壓、冠心病、心律失常等內(nèi)皮素相關(guān)性疾病[2]。近年來酚酸類化合物已成為醫(yī)藥和食品研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[3-7]。用于酚酸類分析的方法有紙色譜（PC）、薄層色譜（TLC）、氣相色譜（GC）、高效液相色譜（HPLC）[8-9]等，而高效毛細(xì)管電泳（HPCE）兼高效液相色譜的高效率及高壓電泳的高速、高分辨率等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又因其樣品處理簡(jiǎn)單、用量少、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，已被廣泛用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、材料學(xué)以及與化學(xué)有關(guān)的化工、環(huán)保、食品、飲料等各個(gè)領(lǐng)域[10-13]。本文利用高效毛細(xì)管電泳測(cè)定了苦丁茶中小分子酚酸類物質(zhì)的含量，以期為苦丁茶資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Beckman P/ACETM MDQ高效毛細(xì)管電泳儀帶二極管陣列（PDA）檢測(cè)器（購自美國貝克曼公司）；未涂層熔融石英毛細(xì)管內(nèi)徑75μm×65cm（購自河北永年與銳灃色譜器件有限公）；ASE3000型快速溶劑萃取儀器（購自美國戴安公司），PHS23精密pH計(jì)（購自上海雷磁儀器廠），7種酚酸物質(zhì)的標(biāo)樣（購自上海源聚生物科技有限公司），四硼酸鈉，磷酸二氫鉀，乙醇等試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品山奈酸、蘆丁、沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸、沒食子酸、原兒茶酸各1.0000mg，用甲醇溶解分別定容至1mL，配制成1.0g/L的標(biāo)準(zhǔn)液，再稀釋為100μg/mL、75μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL的梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用“1.3”中電泳條件檢測(cè)，用外標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品溶液：準(zhǔn)確稱取加工好的苦丁茶樣品5g，用快速溶劑萃取儀進(jìn)行樣品的提取。萃取條件：溫度，40℃；溶劑，70%乙醇；沖洗體積，20%V；2次循環(huán)；靜態(tài)萃取時(shí)間為5min。提取液，過0.22μm微孔濾膜純化樣品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

毛細(xì)管柱在每次使用前依次用0.1mol/L氫氧化鈉溶液、超純水和電泳緩沖液各沖洗10min，更換緩沖液或進(jìn)樣3次后也按上述步驟清洗毛細(xì)管，保證其重現(xiàn)性。采用0.5psi壓力，進(jìn)樣6s，紫外檢測(cè)波長為214nm，20mmol/L pH7.5磷酸二氫鉀-硼砂緩沖液，在分離電壓為20kV，運(yùn)行溫度為25℃的條件下同時(shí)進(jìn)行山奈酸、蘆丁、沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸、沒食子酸、原兒茶酸等7種酚酸類物質(zhì)的分離測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長的確定

如圖1所示，經(jīng)紫外檢測(cè)器在190～400nm波長范圍內(nèi)掃描，綠原酸和咖啡酸的特征吸收峰為300～360nm，蘆丁、槲皮素、沒食子酸和原兒茶酸的特征吸收峰為200～220nm，7種酚酸類物質(zhì)在214nm處都有較強(qiáng)吸收，所以選定214nm為最佳檢測(cè)波長。

圖1 混合標(biāo)樣的紫外特征吸收峰圖（注：1-山奈酸，2-蘆丁，3-槲皮素，4-綠原酸，5-咖啡酸，6-沒食子酸，7-原兒茶酸）Fig.1UV characteristic absorption peak of mixed standard samples(Note:1-kaempferol,2-rutin,3-quercetin,4-chlorogenic acid, 5-caffeine acid,6-gallic acid,7-protocatechuic acid)

2.2 緩沖體系的選擇

2.2.1 緩沖液離子濃度的選擇

本實(shí)驗(yàn)選擇了20、30、40mmol/L三個(gè)離子濃度的磷酸二氫鉀-硼砂緩沖體系。結(jié)果表明（圖2-A），遷移時(shí)間隨著緩沖鹽的離子濃度的增加而增長，分離度隨著緩沖鹽的離子濃度的增加而變小，在20mmol/L的緩沖液濃度時(shí)有一個(gè)最佳的分離。2.2.2緩沖液pH的選擇

本實(shí)驗(yàn)選擇了緩沖液的pH值為7.0、7.5、8.0、8.5時(shí)對(duì)樣品分離度的影響。結(jié)果表明(圖2-B)，遷移時(shí)間隨著pH值的增加而增長，但分離度變差。pH7.0時(shí)，后3峰無法分離；pH7.5時(shí)，在12min之內(nèi)7種酚類物質(zhì)有一個(gè)很好的分離。

2.2.3 分離電壓和溫度的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了工作電壓分別為18、20、22、 24kV時(shí)對(duì)樣品提取液的分離效果。結(jié)果表明（圖2-C），隨著電壓的增加，樣品溶液的分離速度增大，遷移時(shí)間縮短，但當(dāng)電壓為22kV時(shí)，噪音明顯增大，綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇20kV的工作電壓。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了15、20、25、30℃的柱溫對(duì)樣品提取液分離的影響，結(jié)果表明（圖2-D），隨著溫度的升高，遷移時(shí)間縮短，但達(dá)到一定的柱溫后，分離效果明顯降低，本實(shí)驗(yàn)選擇分離最佳時(shí)的25℃柱溫。

圖2 各因素對(duì)遷移時(shí)間的影響Fig.2Effects of various factors on migration time

2.3 回歸方程、相關(guān)系數(shù)的確定

將混合標(biāo)準(zhǔn)樣品用甲醇稀釋為100μg/mL、 75μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/ mL八個(gè)濃度梯度，在最佳的電泳條件下進(jìn)行HPCE測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸處理，得到濃度在6.25～100μg/mL之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程。結(jié)果表明，7種酚酸類物質(zhì)的相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)為0.9982～0.9996，見表1。

表1 線性范圍和回歸方程Table1Regression equation and linear range

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)及精密度

準(zhǔn)確度驗(yàn)證采用添加回收率法進(jìn)行試驗(yàn)。在已知七種酚酸類物質(zhì)含量的苦丁茶提取液中加入已知量的標(biāo)樣溶液后進(jìn)行測(cè)定，實(shí)測(cè)添加量與標(biāo)準(zhǔn)添加量之比為回收率。通過實(shí)驗(yàn)，測(cè)得的儀器的回收率在80.14%～93.24%之間（結(jié)果見表2）。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)（n=3）Table2Experiment of recovery（n=3）

分析方法的重復(fù)性是評(píng)價(jià)其保持不受參數(shù)微小偏差影響的能力，可作為正常使用的一個(gè)可靠性指標(biāo)，取相同樣品6份，按1.2樣品提取、純化方法制備供試液，在最優(yōu)條件下進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，考察各組分的校正峰面積和遷移時(shí)間的重復(fù)性。結(jié)果表明，7種酚酸類物質(zhì)的峰面積RSD≤2.522%，遷移時(shí)間的RSD≤1.561%，見表3。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)Table3Experiment of accuracy

2.5 樣品的分析結(jié)果

按1.2樣品提取、純化方法處理樣品，在最佳的電泳分離條件下，采用外標(biāo)法計(jì)算不同產(chǎn)地苦丁茶7種酚酸類物質(zhì)的含量，圖3和表4結(jié)果顯示，樣品中的7種酚酸類物質(zhì)可以得到有效分離；不同產(chǎn)地的苦丁茶中7種酚酸類物質(zhì)的含量明顯不同，沒食子酸在幾種苦丁成品茶種都未檢測(cè)出。

圖3 標(biāo)樣品（A）和樣品（B）的HPCE色譜圖（注：1-山奈酸，2-蘆丁，3-槲皮素，4-綠原酸，5-咖啡酸，6-沒食子酸，7-原兒茶酸）Fig.3 Electropherograms of standards(A)and sample(B)(Note:1-kaempferol,2-rutin,3-quercetin,4-chlorogenic acid, 5-caffeine acid,6-galli acid,7-protocatechuic acid)

3 結(jié)論

本文通過對(duì)電泳條件進(jìn)行的比較研究，確立了分離測(cè)定苦丁茶山奈酸、蘆丁、槲皮素、綠原酸、咖啡酸、沒食子酸和原兒茶酸等7種酚酸類物質(zhì)的最佳電泳條件：緩沖液采用20mmol/L，pH7.5磷酸二氫鉀-硼砂緩沖液，分離電壓20kV，運(yùn)行溫度25℃，紫外檢測(cè)波長214nm。本方法工作曲線線性關(guān)系良好、結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度高，樣品用量少，分析時(shí)間短，與其他分析方法相比較，高效毛細(xì)管電泳法操作更簡(jiǎn)便、快速，可在12min內(nèi)同時(shí)分離7種物質(zhì)，大大減少了分析成本，為同時(shí)分離檢定多種酚酸類物質(zhì)提供了一個(gè)良好的方法。

表4 不同產(chǎn)地苦丁茶中7種酚酸類物質(zhì)含量比較（單位：μg/g）Table4Comparation of seven phenolic acids in Kudingcha from different areas(unit:μg/g)

酚酸類物質(zhì)是高等植物中普遍存在的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有廣泛的生物活性。關(guān)于苦丁茶酚酸類物質(zhì)的組成，梁月榮等[14]通過分析浙江省大葉冬青苦丁茶中的化學(xué)成分發(fā)現(xiàn)苦丁茶中含有兒茶素和蘆丁等酚酸類物質(zhì)，而Negishi等[15]認(rèn)為苦丁茶冬青苦丁茶的主要酚類化合物為綠原酸及其衍生物。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同產(chǎn)區(qū)的苦丁茶酚酸類化合物的測(cè)定結(jié)果中都不含有沒食子酸，而綠原酸的含量最高；來自源于黃山和四川的苦丁茶中沒有檢測(cè)出咖啡酸和原兒茶酸。

[1]劉韶,秦勇,杜方麓.苦丁茶化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志, 2003,28(9):834-836.

[2]Barberan T,Espin J C.Phenolic compounds and related enzymes as determinant so quality in fruit sand vegetables[J]. SciFoodAgric,2001,81:853-876.

[3]王祥軍,齊軍倉,賈力群,等.反相高效液相色譜法快速測(cè)定大麥籽粒中13種酚酸類化合物[J].分析實(shí)驗(yàn)室,2011,30(11)5-10.

[4]蘇貽娟,馮遠(yuǎn)嬌,羅賜君,等.同效液相色譜法測(cè)定玉米葉片中的酚酸類化合物[J].玉米科學(xué),2009,17(5):166-168.

[5]江和源,蔣迎.茶葉中5種酚酸類化合物的HPLC測(cè)定方法[J].食品工業(yè)科技,2004,25(12):122-124.

[6]龍文靜,張盛,袁玲,等.反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定咖啡豆中的6種酚酸類化合色譜,2011,29(5):439-442.

[7]楊柳,吳金雄,許舜軍,等.蒼耳子中酚酸類化合物的鑒別及綠原酸的含量測(cè)定[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,17(19):85-88.

[8]顏棟美,李仁菊.高效液相色譜法測(cè)定金花茶中5種酚類物質(zhì)的研究[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2010,31(1):59-62.

[9]朱玉,張書勝,張西林,等.薄層色譜法分析葵花仁粕中的綠原酸[J].色譜,2001,19(1):82-84.

[10]汪泰初,張和禹,李瑞雪.高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定蟲草制品中核苷類化合物[J].中國蠶業(yè),2010,(03):14-16.

[11]彭進(jìn)進(jìn),羅澤嬌,李龍媛.高效毛細(xì)管電泳-二極管陣列檢測(cè)法測(cè)定土壤中的苯酚[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào),2012,(01):103-105.

[12]張汆,李敏,賈小麗.芡種殼乙酸乙酯提取物的毛細(xì)管電泳法分離[J].食品工業(yè)科技,2012,4(05):188-190.

[13]韓海峰,王慶,劉霞.聚合離子液體為添加劑的毛細(xì)管電泳法用于快速高效分離飲料中7種有機(jī)酸[J].色譜,2012,(05).113-117.

[14]LIANG Yuerong,MA Weiyang,LU Jianliang,et al.Comparison of chemical compositions ofIlex latifoliaThumb andCamellia sinensisL.[J].Food Chemistry,2001,75:339-343.

[15]Negishi O,Negishi Y,Yamaguchi F,et al.Deodorization with Ku-ding-cha containing a large amount of caffeoyl quinine acid derivatives[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2004,52:5513-5518.

Separation and Determination of Phenolic Acids inIlex kudingcha C.J.Tsengby High Performance Capillary Electrophoresis

LI Juan1,TAN Hua-rong1,YANG Li-xin2,WANG Rong-fu1*

(1.Biotechnology center,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China; 2.College of Life Science,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China)

A high performance capillary electrophoresis(HPCE)method was established for the determination of phenolic acids in Kudingcha,including kaempferol,rutin,quercetin,chlorogenic acid,caffeine acid,gallic acid and protocatechuic acid.The samples were extracted with methanol by fast solvent extraction equipment(ASE3000).The electrophoretic separation conditions,such as ion concentration and pH of buffer, running voltage and capillary temperature were optimized.Results showed that the optimum conditions were the running buffer consisted of 20mmol/L KH2PO4-sodium borate,pH7.5,separation voltage 20kV,running temperature 25℃,and the UV-detection wave length 214 nm.Under these conditions,the seven phenolic acids could be well separated within 13 minutes,and their corresponding coefficient reached from 0.9982 to 0.9996.The RSD values of migration time and peak area were 0.1557%～0.1664%and 1.080%～3.466% respectively.The average recovery percentage was 80.14%～93.24%.Results indicated that this method wasrapid,accurate and simple for determining phenolic acids in Kudingcha coming from different areas.

High performance capillary electrophoresis,Kudingcha,Phenolic acids

2012-11-29

李娟（1977-），女，安徽安慶人，助理研究員，主要從事分析測(cè)試工作。

*通訊作者：rfwang@ahau.edu.cn