茶多酚制品中多酚含量測(cè)定方法比較研究

高玉萍，涂云飛，楊秀芳*，梁慧玲，孔俊豪，龔淑英

（1.中華全國(guó)供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016；2.浙江大學(xué)茶學(xué)系，浙江杭州 310058）

茶多酚制品中多酚含量測(cè)定方法比較研究

高玉萍1,2，涂云飛1，楊秀芳1*，梁慧玲1，孔俊豪1，龔淑英2*

（1.中華全國(guó)供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016；2.浙江大學(xué)茶學(xué)系，浙江杭州 310058）

對(duì)福林酚比色法和酒石酸亞鐵比色法測(cè)定茶多酚制品中多酚含量的適用性進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明：兩種方法在測(cè)定茶多酚制品的多酚含量時(shí)都有良好的穩(wěn)定性（RSD＜5.1）；兩者的測(cè)定原理不同，測(cè)得的結(jié)果具有一定的差距，純度越高的茶多酚制品，兩種方法測(cè)定值之間差距越大；用酒石酸亞鐵比色法測(cè)得的多酚含量有超出100%的現(xiàn)象，福林酚-標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)得的多酚含量在30.08%～88.76%之間。茶多酚制品中多酚含量宜采用福林酚比色法測(cè)定，即福林酚-標(biāo)準(zhǔn)曲線法和福林酚-換算系數(shù)法，且換算系數(shù)為88.13μg/mL。

茶多酚制品，多酚含量，測(cè)定方法，酒石酸亞鐵，福林酚

茶多酚是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，由兒茶素類、黃酮類、黃酮醇類、花青素類、花白素類、酚酸及縮酚酸類等物質(zhì)組成，具有抗氧化、抗衰老、抗輻射、防癌抗癌及調(diào)節(jié)免疫等功效[1]，并應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、日用化學(xué)品、飼料等領(lǐng)域[2-3]。我國(guó)茶資源豐富，利用中低檔茶、碎末茶與夏秋茶提取茶多酚的工藝已非常成熟。目前，全國(guó)大約有近百家規(guī)模不一的茶葉深加工企業(yè)，如安徽紅星藥業(yè)、江西綠康、浙江東方、無(wú)錫世紀(jì)生物、浙江瑞安派諾等。隨著茶多酚行業(yè)的快速發(fā)展，市場(chǎng)亟需一個(gè)統(tǒng)一的產(chǎn)品質(zhì)量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)去規(guī)范和引領(lǐng)，茶多酚制品產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)等相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)體系有待建立。

目前茶葉中茶多酚總量的測(cè)定方法主要包括酒石酸亞鐵絡(luò)合多酚顯色法[4-8]和福林酚氧化多酚顯色法[9-12]。酒石酸亞鐵比色法的原理是在一定的pH條件下茶葉中的多酚類物質(zhì)與亞鐵離子形成藍(lán)紫色絡(luò)合物，是絡(luò)合反應(yīng)；福林酚比色法則是利用福林酚試劑氧化茶多酚中的-OH，并顯藍(lán)色，是氧化還原反應(yīng)[13]。在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)[9-10]體系中，茶葉及速溶茶中多酚含量的測(cè)定已采用福林酚比色法。但茶多酚制品中多酚含量的測(cè)定，至今只有1995年發(fā)布的輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中有所涉及，即茶多酚行業(yè)內(nèi)正在廣泛應(yīng)用的酒石酸亞鐵比色法。該法是否還適用于當(dāng)前茶多酚含量的測(cè)定，值得探討。因此，本文擬通過(guò)分光光度法進(jìn)一步比較分析酒石酸亞鐵比色法和福林酚比色法在測(cè)定茶多酚制品中多酚含量上的適用性，為茶多酚制品中多酚含量檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

不同規(guī)格的茶多酚制品購(gòu)自多個(gè)國(guó)內(nèi)茶多酚生產(chǎn)企業(yè)；兒茶素組分標(biāo)準(zhǔn)品（EGCG、GCG、ECG、EGC、EC，純度≥98%）購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司；咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品由國(guó)家茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心提供；福林酚（Folin-Ciocalteu）試劑購(gòu)自上海聚源生物科技有限公司；酒石酸鉀鈉（純度≥99.0%）購(gòu)自上海美興化工有限公司；七水硫酸亞鐵（純度≥99.0%）購(gòu)自衢州巨化試劑有限公司；無(wú)水碳酸鈉（純度≥98%）購(gòu)自上海美興化工有限公司；沒(méi)食子酸乙酯（純度≥98%）購(gòu)自成都西亞化學(xué)試劑科技有限公司；一水合沒(méi)食子酸（純度≥98.5%）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純）購(gòu)自天津市康科德科技有限公司；冰醋酸（純度≥99.5%）購(gòu)自杭州化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)購(gòu)自尤尼柯上海儀器有限公司；Waters高效液相色譜儀配備Waters 1525雙元泵、柱溫箱、2487雙通道紫外可見(jiàn)檢測(cè)器、717plus自動(dòng)進(jìn)樣器、Breeze控制軟件，購(gòu)自Waters科技（上海）有限公司；AL204電子天平購(gòu)自梅特勒—托利多儀器有限公司；實(shí)驗(yàn)室級(jí)純水器購(gòu)自南京易普達(dá)科技發(fā)展有限公司。

1.3 多酚含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.1g茶多酚樣品于燒杯中，加入小于60℃水25mL左右，充分溶解后冷卻定容至100mL容量瓶中，即為1mg/mL的母液，待用。酒石酸亞鐵比色即用母液，福林酚比色時(shí)取2.5mL母液定容至50mL容量瓶中。酒石酸亞鐵比色法基于中華人民共和國(guó)輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（QB 2154-95）[6]，即1mL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品加入5mL酒石酸亞鐵試劑，充分混勻后用pH7.5的磷酸緩沖液定容至25mL，于540nm測(cè)定1cm比色皿中的吸光值；福林酚比色法參照ISO標(biāo)準(zhǔn)[9]執(zhí)行，即1mL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品加入5mL 10%的福林酚試劑后，于3～8min內(nèi)加入4mL 7.5%的碳酸鈉溶液混勻，反應(yīng)60min后，于765nm處測(cè)定吸光值。

1.4 茶多酚含量計(jì)算

1.4.1 福林酚-標(biāo)準(zhǔn)曲線法

用沒(méi)食子酸（10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按下式計(jì)算茶多酚含量：

式中：E為根據(jù)試樣測(cè)得的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的沒(méi)食子酸相應(yīng)含量，μg/mL；V為樣品溶液的體積，mL（本實(shí)驗(yàn)中為100mL）；d為測(cè)得吸光度前的稀釋因子（本實(shí)驗(yàn)中將2.5mL稀釋到50mL，稀釋因子即為20）；m為樣品質(zhì)量，g；G為試樣水分，%；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0109x+ 0.0084，R2=0.9992。

1.4.2 酒石酸亞鐵-標(biāo)準(zhǔn)曲線法

用沒(méi)食子酸乙酯50mg/100mL、100mg/100mL、150mg/100mL、200mg/100mL、250mg/100mL作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按下式求出茶多酚含量：

式中：E為根據(jù)試樣測(cè)得的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的沒(méi)食子酸乙酯相應(yīng)含量，mg/100mL；1.5為茶多酚的換算系數(shù)；m為樣品質(zhì)量，mg；G為試樣水分，%；沒(méi)食子酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)曲線：y= 0.0057x-0.0051，R2=0.9998。

1.4.3 酒石酸亞鐵-換算系數(shù)法

行業(yè)中常采用酒石酸亞鐵法結(jié)合2.884的換算系數(shù)計(jì)算茶多酚含量，按照下式計(jì)算茶多酚含量：

式中：A為吸光度；V為試樣體積，mL（本實(shí)驗(yàn)中為100mL）；m為樣品質(zhì)量，mg；G為試樣水分，%。

1.5 兒茶素含量測(cè)定

兒茶素含量測(cè)定采用高效液相色譜法[14]，并以咖啡堿作為內(nèi)標(biāo)定量各成分。液相色譜洗脫條件為100%初始相A相（純水含有9%的乙腈，2%的冰醋酸及20μg/mL的EDTA·2Na）維持10min，然后流動(dòng)相B（80%乙腈，2%冰醋酸及20μg/mL的EDTA·2Na的水溶液），經(jīng)15min線性梯度增加至32%，維持10min，再1min回至初始流動(dòng)相A，平衡10min，準(zhǔn)備下一針樣品分析。流速為1mL/min，色譜柱為Hypersil ODS-C18（250mm× 4.6mm i.d.），柱溫35℃±0.5℃。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用辦公軟件Office Excel 2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同測(cè)定方法的穩(wěn)定性比較

隨機(jī)選取高、中、低三種純度的茶多酚樣品（A、B、C）進(jìn)行測(cè)定方法的穩(wěn)定性比較。采用三種不同的處理方式，對(duì)兩種不同的測(cè)定方法（福林酚-標(biāo)準(zhǔn)曲線法和酒石酸亞鐵-標(biāo)準(zhǔn)曲線法）進(jìn)行相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分析。由表1可知，無(wú)論是福林酚比色法還是酒石酸亞鐵比色法，其RSD都在合理的范圍內(nèi)（RSD＜5.1%）。這說(shuō)明，從穩(wěn)定性的角度來(lái)看，兩種方法都是可行的。

表1 兩種方法的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)（n=6）Table 1 Comparison of stability of two methods(n=6)

2.2 不同測(cè)定方法所得結(jié)果的數(shù)值比較

表2為不同方法測(cè)得的茶多酚制品中兒茶素及茶多酚總量結(jié)果，由數(shù)據(jù)分析可以看出，若以福林酚法的數(shù)據(jù)為依據(jù)，兒茶素約占茶多酚總量的73%，說(shuō)明兒茶素總量在多酚中的分布與茶葉相似。不同方法測(cè)得多酚含量數(shù)據(jù)高低依次為：酒石酸亞鐵-換算系數(shù)法＞酒石酸亞鐵-標(biāo)準(zhǔn)曲線法＞福林酚-標(biāo)準(zhǔn)曲線法。在茶多酚純度較低的情況下，三種方法的差距較小，隨著茶多酚純度的增加，三種方法所得結(jié)果之間的差距越來(lái)越大。酒石酸亞鐵-標(biāo)準(zhǔn)曲線法與福林酚-標(biāo)準(zhǔn)曲線法之間的差距為0.14%～23.95%，酒石酸亞鐵-換算系數(shù)法與福林酚-標(biāo)準(zhǔn)曲線法之間的差距為2.36%～34.99%，酒石酸亞鐵-換算系數(shù)法與酒石酸亞鐵-標(biāo)準(zhǔn)曲線法之間的差距為1.87%～11.04%。同時(shí)，由這些數(shù)據(jù)可以獲得三種方法所得結(jié)果的換算公式：

其中：X為根據(jù)福林酚-標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算得到的茶多酚含量數(shù)值；

Y1為根據(jù)酒石酸亞鐵-標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算得到的茶多酚含量數(shù)值；

Y2為根據(jù)酒石酸亞鐵-換算系數(shù)法計(jì)算得到的茶多酚含量數(shù)值。

分析還發(fā)現(xiàn)，利用酒石酸亞鐵-標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)得的結(jié)果中，共4個(gè)樣品的數(shù)據(jù)超過(guò)100%，酒石酸亞鐵-換算系數(shù)法的數(shù)據(jù)更高，共9個(gè)樣品超出100%。而福林酚方法得到的結(jié)果均在100%以內(nèi)。這表明，在利用酒石酸亞鐵比色法測(cè)定茶多酚制品中的多酚含量時(shí)，行業(yè)中廣泛使用的換算系數(shù)過(guò)高，而利用標(biāo)準(zhǔn)曲線也不能夠獲得關(guān)于茶多酚純度的準(zhǔn)確可信的數(shù)據(jù)結(jié)果。因此判斷，現(xiàn)有的兩種利用酒石酸亞鐵比色法測(cè)定多酚含量的方式都不能適用于茶多酚制品中多酚含量的測(cè)定。利用福林酚方法測(cè)得的結(jié)果中，多酚含量的范圍為30.08%～88.76%。

表2 不同方法測(cè)得的茶多酚含量及樣品兒茶素總量Table 2 Total polyphenols'content measured by different methods and total catechins content of samples

2.3 福林酚—換算系數(shù)法研究

現(xiàn)有的福林酚比色法是利用沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)定量多酚含量的，若可以在大量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上根據(jù)不同時(shí)間、不同樣品、不同標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)量獲得一個(gè)換算系數(shù)，便可節(jié)約大量的時(shí)間與成本。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)37個(gè)樣品的福林酚方法測(cè)得的茶多酚含量，計(jì)算獲得福林酚方法的換算系數(shù)：

式中：ω為根據(jù)福林酚方法結(jié)合沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得的茶多酚含量，%；m為樣品質(zhì)量，g；G為試樣水分，%；A為吸光度；V為樣品提取液的體積，mL（本實(shí)驗(yàn)中為100mL）；d為測(cè)得吸光度前的稀釋因子（本實(shí)驗(yàn)中將2.5mL稀釋到50mL，稀釋因子即為20）。

取37個(gè)樣品的平均值，得到福林酚比色法的換算系數(shù)為88.13μg/mL，即單位吸光度對(duì)應(yīng)的多酚濃度為88.13μg/mL。利用該換算系數(shù)得到的多酚含量計(jì)算公式為：

式中字母的含義與上式相同。

由該公式換算得到的樣品茶多酚含量的范圍為30.51%～89.36%，與福林酚—標(biāo)準(zhǔn)曲線法獲得的結(jié)果基本吻合。

3 結(jié)論

現(xiàn)階段茶多酚制品中多酚含量的測(cè)定，仍然采用我國(guó)輕工業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB 2154-1995《食品添加劑茶多酚》，即用酒石酸亞鐵比色法，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行結(jié)果的計(jì)算或業(yè)內(nèi)以該標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)，用經(jīng)驗(yàn)系數(shù)2.884進(jìn)行換算。但是從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果看來(lái)，利用酒石酸亞鐵-換算系數(shù)法與酒石酸亞鐵-標(biāo)準(zhǔn)曲線法，所獲得的茶多酚含量均有高于100%的現(xiàn)象，說(shuō)明利用這兩種方式對(duì)茶多酚制品中茶多酚的含量進(jìn)行測(cè)定時(shí)，測(cè)定結(jié)果偏高，不能準(zhǔn)確反映茶多酚的實(shí)際含量。

福林酚法已作為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法應(yīng)用于茶葉和速溶茶制品中多酚含量的測(cè)定，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》等同采用ISO 14502-1:2005《福林酚（Folin-Ciocalteu）試劑比色法測(cè)定茶葉中茶多酚總量》，以福林酚方法取代酒石酸亞鐵比色法測(cè)定茶葉中的茶多酚含量。本文利用福林酚—標(biāo)準(zhǔn)曲線法開(kāi)展了茶多酚制品中茶多酚含量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)測(cè)定方法簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，37個(gè)純度各異的茶多酚制品的測(cè)定結(jié)果處于30.08%～88.76%范圍之間。同時(shí)通過(guò)分析茶多酚測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)，獲得了更簡(jiǎn)單的測(cè)定方法，即福林酚—換算系數(shù)法，其中換算系數(shù)為88.13μg/mL，利用該換算系數(shù)得到的茶多酚含量范圍為30.51%～89.36%。

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Methods Comparison of Determinating the Polyphenols Content in Tea Polyphenols Products

GAO Yu-ping1,2,TU Yun-fei1,YANG Xiu-fang1*,LIANG Hui-ling1,KONG Jun-hao1,GONG Shu-ying2*
(1.Hangzhou Tea Research Institute,CHINA COOP,Hangzhou 310016,China; 2.Department of Tea Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

Tea polyphenol product is a kind of complex product extracted from tea.Applicability of ferrous tartrate method and Folin-Ciocalteu method in determining total polyphenols'content of tea polyphenol products were discussed in this paper.The results showed that both of them were stable with RSD＜5.1.Two methods had different results,because the measuring principles of them were different.As the purity of tea polyphenol products improving,differences between two methods'results were bigger.Status of Folin-Ciocalteu-standard curve method ranged from 30.08%to 88.76%while several data of ferrous tartrate method exceeded 100%.It was summarized that Folin-Ciocalteu methods including Folin-Ciocalteu-standard curve method and Folin-Ciocalteu-conversion ratio method were better than ferrous tartrate method in determining total polyphenols'content of tea polyphenol products and it was calculated that the conversion coefficient was 88.13μg/mL.

Tea polyphenols products,Total polyphenols'content,Methodologies,Ferrous tartrate, Folin-Ciocalteu

TS272.5；Q946.8

A

2095-0306（2013）03-0028-05

2013-06-17

國(guó)家質(zhì)檢公益項(xiàng)目（201110210）

高玉萍（1988-），女，山東泰安人，碩士，主要從事茶葉品質(zhì)化學(xué)、茶資源綜合利用及茶葉加工與審評(píng)的研究。

*通訊作者：teatesting@sina.com,shuygong@zju.edu.cn

中國(guó)茶葉加工2013，（3）:28～32