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    基質(zhì)分散萃取——反相高效液相色譜法測(cè)定楊梅中氯吡脲

    2013-04-11 05:28:32朱杰麗吳翠蓉柴振林周利雄
    關(guān)鍵詞:氯吡脲出峰楊梅

    楊 柳,朱杰麗,吳翠蓉,陸 軍,柴振林*,周利雄

    (1.浙江省林產(chǎn)質(zhì)量檢測(cè)站,浙江 杭州 310023;2.江山市林業(yè)局,浙江 江山 323700)

    氯吡脲是一種高活性的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,主要成分為1-(2-氯-4-吡啶基)-3-苯基脲,具有促進(jìn)細(xì)胞分裂、提高光合作用效率、增強(qiáng)抗逆性、保花保果、提高坐果率、果實(shí)膨大等作用,對(duì)作物采后生理也有積極作用[1-2]。目前,氯吡脲已應(yīng)用于西瓜、葡萄、獼猴桃等多種農(nóng)作物,在美國(guó)、歐盟、日本等國(guó)也都允許使用。因氯吡脲可能會(huì)對(duì)人體帶來(lái)潛在的健康危害,歐盟、日本等對(duì)其殘留量作出了嚴(yán)格限定,其中日本“肯定列表”對(duì)部分漿果限量為0.02 mg/kg,而美國(guó)早在1996年便規(guī)定氯吡脲在獼猴桃中的限量為0.04 mg/kg[3],我國(guó)在2009年也出臺(tái)了相應(yīng)的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),對(duì)西瓜、黃瓜、獼猴桃和葡萄中氯吡脲作了限量規(guī)定[4],但在楊梅上還沒(méi)有限量規(guī)定及成熟的測(cè)定方法。目前,有關(guān)氯吡脲檢測(cè)方法的報(bào)道主要是液相色譜法[5-7]、液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(LC/TOF-MS)法[8],涉及的樣品有獼猴桃、黃瓜、西瓜、葡萄、土壤等[9-10],楊梅中氯吡脲的測(cè)定未見(jiàn)報(bào)道。楊梅屬楊梅科楊梅屬的亞熱帶常綠果樹(shù),原產(chǎn)于中國(guó)東南部,是浙江省特色水果栽培面積最大,產(chǎn)量最高,品質(zhì)最佳,然而楊梅成熟于高溫多雨季節(jié),又為漿果且無(wú)外果皮,外噴藥劑極易侵入果實(shí)可食部分,產(chǎn)生安全隱患[11-12]。

    本試驗(yàn)基于 NY/T 761 -2008[13]、NY/T 1680 -2009[14]用乙腈作為提取劑,高速分散器作為提取設(shè)備,氨基小柱為凈化柱,甲醇為淋洗、乙腈定容,建立了楊梅中氯吡脲殘留的基質(zhì)分散萃取——反相高效液相色譜檢測(cè)方法,可為楊梅中氯吡脲殘留限量設(shè)定及標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法的確定提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試驗(yàn)材料、儀器設(shè)備與試劑 楊梅樣品來(lái)源于浙江省臨海市楊梅實(shí)驗(yàn)基地。

    DIONX P680高效液相色譜儀(美國(guó)戴安),配ASI-100四元泵系統(tǒng)配置、UV170U四通道紫外檢測(cè)器,Kromasil C18(250mm ×4.6mm,5μm)不銹鋼柱,IKA T18 basic高速分散器,Autoscience AS3120A超聲波清洗器,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi)等,氨基柱(500 mg/6mL),固相萃取、真空裝置(Supelco),磨樣機(jī)(Joyoung)。

    甲醇、乙腈均為色譜純(Tedia Company USA),氯化鈉為分析純。氯吡脲(98.7%)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購(gòu)于Sigma公司,用流動(dòng)相配制成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    1.1.2 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18(250mm×4.6mm,5 μm)不銹鋼柱;以流動(dòng)相∶乙腈∶水(67/33,V/V)為流動(dòng)相,經(jīng)過(guò)0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾和超聲波脫氣處理;柱溫40℃;流速1mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm;進(jìn)樣量10μL;外標(biāo)法定量。

    1.2 樣品制備及提取、凈化

    磨樣磨制楊梅樣品1 kg,從中稱取25.00 g于150mL高型燒杯中,加50mL乙腈,于高速分散器分散提取1min(15000 r/min)后過(guò)濾于預(yù)先裝有5 g氯化鈉的50mL長(zhǎng)直試管中,蓋上蓋子劇烈振搖30 s以上,靜置30min,待分層停止后凈化。吸取上清乙腈提取液10mL于平底燒瓶中,40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干,取下后用10mL甲醇分3次洗入甲醇預(yù)洗過(guò)的固相萃取小柱內(nèi),保持柱流速度為20 d/min,待前一次洗入液沒(méi)于柱內(nèi)時(shí)及時(shí)將下一次的注入。取出淋洗液再次旋干,5mL乙腈定容、超聲溶解,經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾于進(jìn)樣瓶中,待測(cè)。各處理均6次重復(fù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 提取、凈化方法的選擇

    本次試驗(yàn)分別采用乙腈、甲醇作為提取劑,經(jīng)基質(zhì)分散萃取、渦旋、振蕩、超聲等方法提取。本試驗(yàn)樣品中含有豐富的糖份,采用甲醇提取時(shí)過(guò)濾較慢,以致難以進(jìn)行,而乙腈提取則無(wú)此現(xiàn)象且后續(xù)的測(cè)定結(jié)果良好,本試驗(yàn)結(jié)合楊梅安全指標(biāo)中有敵敵畏、氯氰菊酯、多菌靈等農(nóng)藥且均以乙腈作為提取劑[13-14],最終確定以乙腈作為提取液,同時(shí)對(duì)4種提取方法進(jìn)行篩選。實(shí)驗(yàn)表明4種提取方法的樣品添加回收率均能達(dá)85%以上,其中基質(zhì)分散萃取法速度快、易操作,振蕩和超聲提取法較耗時(shí),渦旋時(shí)低速振蕩不充分、高速手勢(shì)難控制。在選擇凈化小柱時(shí),本試驗(yàn)同時(shí)采用了氨基柱、弗羅里硅土柱和堿性氧化鋁柱等3種凈化柱,結(jié)果表明,3種柱子對(duì)楊梅樣品均有一定的凈化作用,但經(jīng)弗羅里硅土柱或氧化鋁柱凈化后的樣品測(cè)定液成分相對(duì)較復(fù)雜,樣品譜圖中氯吡脲的干擾峰較多,難徹底分離。采用氨基柱凈化后的測(cè)定譜圖顯示氯吡脲峰形較好,干擾峰較少,回收率佳。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果確定以乙腈作為提取劑、基質(zhì)分散萃取法作為提取方法,氨基小柱作為凈化柱[9-10]。經(jīng)試驗(yàn)表明,該提取方法是切實(shí)可行的。

    2.2 流動(dòng)相的選擇

    分析氯吡脲的分子式與分子量,選擇了C18反相鍵合相色譜柱。據(jù)文獻(xiàn)[9-10]報(bào)道氯吡脲測(cè)定可采用乙腈/水或甲醇/水作為流動(dòng)相,本試驗(yàn)比較標(biāo)樣與樣品在不同比例的乙腈/水或甲醇/水流動(dòng)相中的出峰情況,以甲醇/水作為流動(dòng)相時(shí)氯吡脲出峰相對(duì)較慢,峰寬較寬且在氯吡脲周圍的干擾峰較多;而采用乙腈/水不僅可以明顯縮短氯吡脲的出峰時(shí)間且干擾峰少、峰形好,可明顯降低氯吡脲的檢出限。如圖1、2所示,分別以乙腈/水、甲醇/水為流動(dòng)相,濃度為26.6 μg/mL的氯吡脲的出峰圖譜。

    圖1 以乙腈/水為流動(dòng)相的氯吡脲26.6 μg/mL色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard sample of 26.6 μg/mL forchlorfenuron by Acetonitrile/water as mobile phase

    圖2 以甲醇/水為流動(dòng)相的氯吡脲26.6 μg/mL色譜圖Fig.2 Chromatogram of standard sample of 26.6 μg/mL forchlorfenuron by methanol/water as mobile phase

    2.3 定性分析

    對(duì)氯吡脲的定性,本試驗(yàn)采用對(duì)照標(biāo)樣與樣品組份的保留時(shí)間及樣品中加入標(biāo)樣峰疊加來(lái)確定,表1是添加濃度為25 mg/kg的樣品和濃度為26.6 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液中氯吡脲6次出峰時(shí)間對(duì)比,變異系數(shù)分別為 0.094、0.150,平均出峰時(shí)間為 4.983、4.991。利用流動(dòng)相配制標(biāo)準(zhǔn)溶液分別為 0.125、0.25、5.0、25、50和100 μg/mL系列濃度的氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)樣10μL,其色譜峰面積與濃度呈極顯著線性相關(guān),其線性方程與線性范圍分別為:

    表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品添加保留時(shí)間的重現(xiàn)性Tab.1 Reproducibility of retention time of standard and sample

    2.4 檢測(cè)限的測(cè)定

    3倍信噪比(S/N=3)時(shí)最低檢出量為1.0×10-10g,按前述樣品稱量和定容條件,本方法樣品中氯吡脲檢測(cè)限為0.01 mg/kg。

    2.5 加標(biāo)回收及方法精密度

    準(zhǔn)確稱取 25 g樣品6×4份 ,加入氯吡脲標(biāo)液,使其濃度分別為0.00、0.04、7.5、25 mg/kg的6 次重復(fù),輕輕振搖,使其均勻分散開(kāi)。按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行提取、凈化、濃縮、定容、檢測(cè)??瞻讟悠贰⑻砑踊厥諛悠返纳V峰如圖2、圖3所示。楊梅空白樣品中未檢測(cè)到氯吡脲,添加樣品回收率結(jié)果如表2所示。

    表2 添加回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Tab.2 Recoveries rate and relative standard deviations(n=6)

    由表2可知,氯吡脲在樣品不同濃度添加回收率在98.4% ~11%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.97% ~2.6%,表明本方法的準(zhǔn)確度和精密度均可滿足痕量組分測(cè)定要求,可以對(duì)楊梅中氯吡脲含量進(jìn)行測(cè)定。

    3 討論

    楊梅果實(shí)中含有大量的水分,在選擇提取劑時(shí)考慮到極性溶劑,它能與水互溶從而滲透到組織內(nèi)部,改變?nèi)芤簶O性后又能與水分離。丙酮、甲醇是良好的提取劑,但不易與水分離;二氯甲烷、三氯甲烷對(duì)人體毒性較大,且對(duì)色素有較強(qiáng)的溶解性,故未選擇。相比之下乙腈是較為理想的提取劑,它不但具備上述要求的溶劑性質(zhì),而且對(duì)試樣中的糖、脂肪和蛋白質(zhì)的溶解性較小,降低了基體中雜質(zhì)的溶出;同時(shí),它的低揮發(fā)性也減少了對(duì)人體健康和環(huán)境的危害。已有文獻(xiàn)[6,15-17]報(bào)道,植物樣品中氯吡脲可采用乙腈或甲醇作為提取劑。由于甲醇和乙腈二者極性差異明顯,對(duì)不同的樣品可選擇采用,如一些含糖量較高或水溶性物質(zhì)較多的樣品宜采用乙腈,而脂溶性成分較多的樣品宜采用甲醇。本實(shí)驗(yàn)所用的楊梅糖分含量較高,故采用的乙腈作為提取劑。氯吡脲測(cè)定可采用乙腈/水[16-17]或甲醇/水[6,15]作為流動(dòng)相,本試驗(yàn)比較標(biāo)樣與樣品在不同比例的乙腈/水或甲醇/水流動(dòng)相中的出峰情況發(fā)現(xiàn),以甲醇/水作為流動(dòng)相時(shí)氯吡脲出峰相對(duì)較慢,且峰寬較寬且在氯吡脲周圍的干擾峰較多;而采用乙腈/水不僅可以明顯縮短氯吡脲的出峰時(shí)間且干擾峰少、峰形好,可明顯降低氯吡脲的檢出限,這與Antonio[8]在西紅柿、南瓜、西瓜中的測(cè)定結(jié)果相似。在選擇流動(dòng)相流速時(shí),0.5mL/min時(shí)峰分離明顯優(yōu)于1mL/min但出峰時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。在選擇凈化小柱時(shí),本試驗(yàn)同時(shí)采用了弗羅里硅土柱和堿性氧化鋁柱,三種柱子對(duì)楊梅樣品均有一定的凈化作用,但經(jīng)弗羅里硅土柱或氧化鋁柱凈化后的樣品測(cè)定液成分相對(duì)較復(fù)雜,樣品譜圖中氯吡脲的干擾峰較多,難徹底分離。采用氨基柱凈化后的測(cè)定譜圖顯示氯吡脲峰形較好,干擾峰較少,與侯玉茹[18]在葡萄中的研究結(jié)果略有差異,這可能與楊梅樣品水分含量較高,所含物質(zhì)與各凈化柱的親和能力有關(guān)。本方法可結(jié)合楊梅中農(nóng)藥殘留測(cè)定一起進(jìn)行前處理[13],節(jié)省時(shí)間和有機(jī)試劑。

    圖3 楊梅添加0 mg/kg氯吡脲的色譜圖Fig.3 Chromatogram of Myica rubra without forchlorfenuron as control

    圖4 楊梅添加7.5 mg/kg氯吡脲的色譜圖Fig.4 Chromatogram of Myica rubra sample spiked with 7.5 mg/kg of forchlorfenuron

    4 結(jié)論

    通過(guò)對(duì)儀器條件和樣品處理進(jìn)行優(yōu)化,建立基質(zhì)分散萃取——反相高效液相色譜法測(cè)定楊梅中氯吡脲的方法,本方法測(cè)定氯吡脲線性范圍廣,樣品中氯吡脲檢測(cè)限可達(dá)0.01 mg/kg;不同濃度添加回收率在98.4% ~110%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.97% ~2.6%;操作簡(jiǎn)便快捷、省時(shí)省力。

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