基質(zhì)分散萃取——反相高效液相色譜法測(cè)定楊梅中氯吡脲

楊 柳，朱杰麗，吳翠蓉，陸 軍，柴振林*，周利雄

(1.浙江省林產(chǎn)質(zhì)量檢測(cè)站，浙江 杭州 310023;2.江山市林業(yè)局，浙江 江山 323700)

氯吡脲是一種高活性的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，主要成分為1－(2－氯－4－吡啶基)－3－苯基脲，具有促進(jìn)細(xì)胞分裂、提高光合作用效率、增強(qiáng)抗逆性、保花保果、提高坐果率、果實(shí)膨大等作用，對(duì)作物采后生理也有積極作用［1－2］。目前，氯吡脲已應(yīng)用于西瓜、葡萄、獼猴桃等多種農(nóng)作物，在美國(guó)、歐盟、日本等國(guó)也都允許使用。因氯吡脲可能會(huì)對(duì)人體帶來(lái)潛在的健康危害，歐盟、日本等對(duì)其殘留量作出了嚴(yán)格限定，其中日本“肯定列表”對(duì)部分漿果限量為0.02 mg/kg，而美國(guó)早在1996年便規(guī)定氯吡脲在獼猴桃中的限量為0.04 mg/kg［3］，我國(guó)在2009年也出臺(tái)了相應(yīng)的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)西瓜、黃瓜、獼猴桃和葡萄中氯吡脲作了限量規(guī)定［4］，但在楊梅上還沒(méi)有限量規(guī)定及成熟的測(cè)定方法。目前，有關(guān)氯吡脲檢測(cè)方法的報(bào)道主要是液相色譜法［5－7］、液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(LC/TOF-MS)法［8］，涉及的樣品有獼猴桃、黃瓜、西瓜、葡萄、土壤等［9－10］，楊梅中氯吡脲的測(cè)定未見(jiàn)報(bào)道。楊梅屬楊梅科楊梅屬的亞熱帶常綠果樹(shù)，原產(chǎn)于中國(guó)東南部，是浙江省特色水果栽培面積最大，產(chǎn)量最高，品質(zhì)最佳，然而楊梅成熟于高溫多雨季節(jié)，又為漿果且無(wú)外果皮，外噴藥劑極易侵入果實(shí)可食部分，產(chǎn)生安全隱患［11－12］。

本試驗(yàn)基于 NY/T 761 －2008［13］、NY/T 1680 －2009［14］用乙腈作為提取劑，高速分散器作為提取設(shè)備，氨基小柱為凈化柱，甲醇為淋洗、乙腈定容，建立了楊梅中氯吡脲殘留的基質(zhì)分散萃取——反相高效液相色譜檢測(cè)方法，可為楊梅中氯吡脲殘留限量設(shè)定及標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法的確定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料、儀器設(shè)備與試劑 楊梅樣品來(lái)源于浙江省臨海市楊梅實(shí)驗(yàn)基地。

DIONX P680高效液相色譜儀(美國(guó)戴安)，配ASI-100四元泵系統(tǒng)配置、UV170U四通道紫外檢測(cè)器，Kromasil C18(250mm ×4.6mm，5μm)不銹鋼柱，IKA T18 basic高速分散器，Autoscience AS3120A超聲波清洗器，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi)等，氨基柱(500 mg/6mL)，固相萃取、真空裝置(Supelco)，磨樣機(jī)(Joyoung)。

甲醇、乙腈均為色譜純(Tedia Company USA)，氯化鈉為分析純。氯吡脲(98.7%)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購(gòu)于Sigma公司，用流動(dòng)相配制成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.1.2 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18(250mm×4.6mm，5 μm)不銹鋼柱;以流動(dòng)相∶乙腈∶水(67/33，V/V)為流動(dòng)相，經(jīng)過(guò)0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾和超聲波脫氣處理;柱溫40℃;流速1mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm;進(jìn)樣量10μL;外標(biāo)法定量。

1.2 樣品制備及提取、凈化

磨樣磨制楊梅樣品1 kg，從中稱取25.00 g于150mL高型燒杯中，加50mL乙腈，于高速分散器分散提取1min(15000 r/min)后過(guò)濾于預(yù)先裝有5 g氯化鈉的50mL長(zhǎng)直試管中，蓋上蓋子劇烈振搖30 s以上，靜置30min，待分層停止后凈化。吸取上清乙腈提取液10mL于平底燒瓶中，40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干，取下后用10mL甲醇分3次洗入甲醇預(yù)洗過(guò)的固相萃取小柱內(nèi)，保持柱流速度為20 d/min，待前一次洗入液沒(méi)于柱內(nèi)時(shí)及時(shí)將下一次的注入。取出淋洗液再次旋干，5mL乙腈定容、超聲溶解，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾于進(jìn)樣瓶中，待測(cè)。各處理均6次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取、凈化方法的選擇

本次試驗(yàn)分別采用乙腈、甲醇作為提取劑，經(jīng)基質(zhì)分散萃取、渦旋、振蕩、超聲等方法提取。本試驗(yàn)樣品中含有豐富的糖份，采用甲醇提取時(shí)過(guò)濾較慢，以致難以進(jìn)行，而乙腈提取則無(wú)此現(xiàn)象且后續(xù)的測(cè)定結(jié)果良好，本試驗(yàn)結(jié)合楊梅安全指標(biāo)中有敵敵畏、氯氰菊酯、多菌靈等農(nóng)藥且均以乙腈作為提取劑［13－14］，最終確定以乙腈作為提取液，同時(shí)對(duì)4種提取方法進(jìn)行篩選。實(shí)驗(yàn)表明4種提取方法的樣品添加回收率均能達(dá)85%以上，其中基質(zhì)分散萃取法速度快、易操作，振蕩和超聲提取法較耗時(shí)，渦旋時(shí)低速振蕩不充分、高速手勢(shì)難控制。在選擇凈化小柱時(shí)，本試驗(yàn)同時(shí)采用了氨基柱、弗羅里硅土柱和堿性氧化鋁柱等3種凈化柱，結(jié)果表明，3種柱子對(duì)楊梅樣品均有一定的凈化作用，但經(jīng)弗羅里硅土柱或氧化鋁柱凈化后的樣品測(cè)定液成分相對(duì)較復(fù)雜，樣品譜圖中氯吡脲的干擾峰較多，難徹底分離。采用氨基柱凈化后的測(cè)定譜圖顯示氯吡脲峰形較好，干擾峰較少，回收率佳。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果確定以乙腈作為提取劑、基質(zhì)分散萃取法作為提取方法，氨基小柱作為凈化柱［9－10］。經(jīng)試驗(yàn)表明，該提取方法是切實(shí)可行的。

2.2 流動(dòng)相的選擇

分析氯吡脲的分子式與分子量，選擇了C18反相鍵合相色譜柱。據(jù)文獻(xiàn)［9－10］報(bào)道氯吡脲測(cè)定可采用乙腈/水或甲醇/水作為流動(dòng)相，本試驗(yàn)比較標(biāo)樣與樣品在不同比例的乙腈/水或甲醇/水流動(dòng)相中的出峰情況，以甲醇/水作為流動(dòng)相時(shí)氯吡脲出峰相對(duì)較慢，峰寬較寬且在氯吡脲周圍的干擾峰較多;而采用乙腈/水不僅可以明顯縮短氯吡脲的出峰時(shí)間且干擾峰少、峰形好，可明顯降低氯吡脲的檢出限。如圖1、2所示，分別以乙腈/水、甲醇/水為流動(dòng)相，濃度為26.6 μg/mL的氯吡脲的出峰圖譜。

圖1 以乙腈/水為流動(dòng)相的氯吡脲26.6 μg/mL色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard sample of 26.6 μg/mL forchlorfenuron by Acetonitrile/water as mobile phase

圖2 以甲醇/水為流動(dòng)相的氯吡脲26.6 μg/mL色譜圖Fig.2 Chromatogram of standard sample of 26.6 μg/mL forchlorfenuron by methanol/water as mobile phase

2.3 定性分析

對(duì)氯吡脲的定性，本試驗(yàn)采用對(duì)照標(biāo)樣與樣品組份的保留時(shí)間及樣品中加入標(biāo)樣峰疊加來(lái)確定，表1是添加濃度為25 mg/kg的樣品和濃度為26.6 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液中氯吡脲6次出峰時(shí)間對(duì)比，變異系數(shù)分別為 0.094、0.150，平均出峰時(shí)間為 4.983、4.991。利用流動(dòng)相配制標(biāo)準(zhǔn)溶液分別為 0.125、0.25、5.0、25、50和100 μg/mL系列濃度的氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣10μL，其色譜峰面積與濃度呈極顯著線性相關(guān)，其線性方程與線性范圍分別為:

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品添加保留時(shí)間的重現(xiàn)性Tab.1 Reproducibility of retention time of standard and sample

2.4 檢測(cè)限的測(cè)定

3倍信噪比(S/N=3)時(shí)最低檢出量為1.0×10－10g，按前述樣品稱量和定容條件，本方法樣品中氯吡脲檢測(cè)限為0.01 mg/kg。

2.5 加標(biāo)回收及方法精密度

準(zhǔn)確稱取 25 g樣品6×4份 ，加入氯吡脲標(biāo)液，使其濃度分別為0.00、0.04、7.5、25 mg/kg的6 次重復(fù)，輕輕振搖，使其均勻分散開(kāi)。按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行提取、凈化、濃縮、定容、檢測(cè)?？瞻讟悠贰⑻砑踊厥諛悠返纳V峰如圖2、圖3所示。楊梅空白樣品中未檢測(cè)到氯吡脲，添加樣品回收率結(jié)果如表2所示。

表2 添加回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Tab.2 Recoveries rate and relative standard deviations(n=6)

由表2可知，氯吡脲在樣品不同濃度添加回收率在98.4% ～11%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.97% ～2.6%，表明本方法的準(zhǔn)確度和精密度均可滿足痕量組分測(cè)定要求，可以對(duì)楊梅中氯吡脲含量進(jìn)行測(cè)定。

3 討論

楊梅果實(shí)中含有大量的水分，在選擇提取劑時(shí)考慮到極性溶劑，它能與水互溶從而滲透到組織內(nèi)部，改變?nèi)芤簶O性后又能與水分離。丙酮、甲醇是良好的提取劑，但不易與水分離;二氯甲烷、三氯甲烷對(duì)人體毒性較大，且對(duì)色素有較強(qiáng)的溶解性，故未選擇。相比之下乙腈是較為理想的提取劑，它不但具備上述要求的溶劑性質(zhì)，而且對(duì)試樣中的糖、脂肪和蛋白質(zhì)的溶解性較小，降低了基體中雜質(zhì)的溶出;同時(shí)，它的低揮發(fā)性也減少了對(duì)人體健康和環(huán)境的危害。已有文獻(xiàn)［6，15－17］報(bào)道，植物樣品中氯吡脲可采用乙腈或甲醇作為提取劑。由于甲醇和乙腈二者極性差異明顯，對(duì)不同的樣品可選擇采用，如一些含糖量較高或水溶性物質(zhì)較多的樣品宜采用乙腈，而脂溶性成分較多的樣品宜采用甲醇。本實(shí)驗(yàn)所用的楊梅糖分含量較高，故采用的乙腈作為提取劑。氯吡脲測(cè)定可采用乙腈/水［16－17］或甲醇/水［6，15］作為流動(dòng)相，本試驗(yàn)比較標(biāo)樣與樣品在不同比例的乙腈/水或甲醇/水流動(dòng)相中的出峰情況發(fā)現(xiàn)，以甲醇/水作為流動(dòng)相時(shí)氯吡脲出峰相對(duì)較慢，且峰寬較寬且在氯吡脲周圍的干擾峰較多;而采用乙腈/水不僅可以明顯縮短氯吡脲的出峰時(shí)間且干擾峰少、峰形好，可明顯降低氯吡脲的檢出限，這與Antonio［8］在西紅柿、南瓜、西瓜中的測(cè)定結(jié)果相似。在選擇流動(dòng)相流速時(shí)，0.5mL/min時(shí)峰分離明顯優(yōu)于1mL/min但出峰時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。在選擇凈化小柱時(shí)，本試驗(yàn)同時(shí)采用了弗羅里硅土柱和堿性氧化鋁柱，三種柱子對(duì)楊梅樣品均有一定的凈化作用，但經(jīng)弗羅里硅土柱或氧化鋁柱凈化后的樣品測(cè)定液成分相對(duì)較復(fù)雜，樣品譜圖中氯吡脲的干擾峰較多，難徹底分離。采用氨基柱凈化后的測(cè)定譜圖顯示氯吡脲峰形較好，干擾峰較少，與侯玉茹［18］在葡萄中的研究結(jié)果略有差異，這可能與楊梅樣品水分含量較高，所含物質(zhì)與各凈化柱的親和能力有關(guān)。本方法可結(jié)合楊梅中農(nóng)藥殘留測(cè)定一起進(jìn)行前處理［13］，節(jié)省時(shí)間和有機(jī)試劑。

圖3 楊梅添加0 mg/kg氯吡脲的色譜圖Fig.3 Chromatogram of Myica rubra without forchlorfenuron as control

圖4 楊梅添加7.5 mg/kg氯吡脲的色譜圖Fig.4 Chromatogram of Myica rubra sample spiked with 7.5 mg/kg of forchlorfenuron

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)儀器條件和樣品處理進(jìn)行優(yōu)化，建立基質(zhì)分散萃取——反相高效液相色譜法測(cè)定楊梅中氯吡脲的方法，本方法測(cè)定氯吡脲線性范圍廣，樣品中氯吡脲檢測(cè)限可達(dá)0.01 mg/kg;不同濃度添加回收率在98.4% ～110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.97% ～2.6%;操作簡(jiǎn)便快捷、省時(shí)省力。

［1］Kassem H A，Al－ Obeed R S，Ahmed M A.Extending harvest season，improving fruit quality and shelf life of‘Barhee’date palm by preharvest sprays［J］.Acta Horticulturae，2010，882:147 －154.

［2］Ted E C，Bruce W W，Ni X Z.Application of plant growth regulators mitigates chlorotic foliar injury by the black pecan aphid(Hemiptera;Aphididae)［J］.Pest Management Science，2010，66(11):1236 －1242.

［3］National registration authority for agricultural and veterinary chemicals.MRL Standard，maximum rcsidue limits in food and animal feedstufs［S］.APVMA，Canberra，1996.

［4］NY 1500.75.3 －2009農(nóng)藥最大殘留限量 氯吡脲［S］.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

［5］LIU Qiang，GONG Da－xin，PENG Xiao－chun，et al.Determination of forchlorfenuron dissipation and residue in cucumbers and red soil［J］.Journal of Northeast Agricultural University(English Edition)2010，17(1):27－3.

［6］孫大利，鄭尊濤，葉火春，等.氯吡脲在葡萄中的殘留分析方法及消解動(dòng)態(tài)［J］.農(nóng)藥，2011，50(10):751－753.

［7］Maki K，Ichiro T，Yasuhiro T，et al.Clean-up method of forchlorfenuron in agricultural products for hplc analysi［J］.Journal of Food Hygiene，2007，48(5):148 －152.

［8］Antonio V，Ana A，Carmen F.Analysis of forchlorfenuron in vegetables by LC/TOF－MS after extraction with the bufered QuEChERS method［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58(5):2818 －2823.

［9］Patil S B，Jadhav M R，Adsule，et al.Multiresidue analysis of multiclass plant growth regulators in grapes by liquid chromatography/tandem mass spectrometry［J］.Journal of AOAC International，2011，943:1060 －3271.

［10］Valverde A，Piedra L，Aguilera A，et al.Analysis and residue levels of forchlorfenuron(CPPU)in watermelons［J］.Journal of Environmental Science and Health.Part B，Pesticides，F(xiàn)ood Contaminants and Agricultural Wastes，2007，42(7):801 －807.

［11］張潔，郭金星，張汝忠，等.東魁楊梅果實(shí)儲(chǔ)藏期揮發(fā)性有機(jī)化合物成分的變化［J］.浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，29:(1);143－150.

［12］顏曉捷，黃堅(jiān)欽，邱智敏，等.生草栽培對(duì)楊梅果園土壤理化性質(zhì)和果實(shí)品質(zhì)的影響［J］.浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，28:(6);850－854.

［13］NY/T 761－2008蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測(cè)定［S］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2008.

［14］GB/T 23380－2009水果、蔬菜中多菌靈殘留的測(cè)定:高效液相色譜法［S］.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

［15］齊明芳.3種常用坐果激素主要成分在番茄中的殘留［J］.農(nóng)藥，2010，49(7):512－514.

［16］鄭玲，李麗華，黃大新，等.液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)水果中氯吡脲殘留的測(cè)定［J］.食品工業(yè)，2011(7):90－92.

［17］李瑞娟，于建壘，宋國(guó)春，等.氯吡脲在獼猴桃和土中的消解動(dòng)態(tài)與殘留測(cè)定［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(2):78－80，83.

［18］侯玉茹，楊媛，石磊，等.固相萃取:高效液相色譜法檢測(cè)葡萄中氯吡脲的研究［J］.食品科技，2011，36(1):255－258.