EM對嗜水氣單胞菌體外抑制作用試驗(yàn)

朱芝秀，何后軍，張文波，鄔向東，萬 根，鄧舜洲，劉松林

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，江西 南昌 330045)

嗜水氣單胞菌廣泛存在淡水、污水、淤泥及土壤中，其致病性菌株可產(chǎn)生氣溶素、溶血素、細(xì)胞毒性、腸毒素、胞外蛋白等。該菌的感染譜廣，可感染魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類等動(dòng)物。嗜水氣單胞菌是典型的人－獸－魚共患病病原菌[1]，也是我國淡水養(yǎng)殖魚暴發(fā)性傳染病的主要病原之一[2]，該病的高發(fā)期為每年的5—10月，此時(shí)溫度適宜，水體中嗜水氣單胞菌大量繁殖，可引起該病的爆發(fā)。

長期以來，我國水產(chǎn)動(dòng)物病害控制主要依靠各種抗菌藥物及消毒劑。長期濫用藥物，不僅使藥物作用受到制約，延誤治病，造成大量死亡和藥物投入的雙重?fù)p失，還可誘發(fā)細(xì)菌基因突變或因轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致無藥可用，更嚴(yán)重的是藥物在魚體內(nèi)殘留和對養(yǎng)殖環(huán)境的嚴(yán)重污染，違背發(fā)展無公害食品的宗旨，危害人體健康，破壞水體生態(tài)環(huán)境。因此，尋找新的環(huán)境友好病害防控措施，使我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展已迫在眉睫。

EM(Effective Microorganisms)微生態(tài)制劑由光合細(xì)菌、乳酸菌群、酵母菌群、放線菌群、絲狀菌群等5科10屬80余種微生物組成。它是由世界著名應(yīng)用微生物學(xué)家日本琉球大學(xué)比嘉照夫教授發(fā)明的，EM技術(shù)是目前世界上應(yīng)用范圍最廣的一項(xiàng)生物工程技術(shù)。EM體內(nèi)抑菌機(jī)理:在動(dòng)物消化道內(nèi)產(chǎn)生有益菌群，與致病菌間就生存和繁殖的空間、時(shí)間、定居部位以及營養(yǎng)素等展開競爭，抑制致病菌的生存、繁殖、定居以及附著[3]。EM在養(yǎng)殖水體中的抑菌機(jī)理:EM滲入水體后，它就會與所到之處的良性力量迅速結(jié)合，產(chǎn)生抗氧化物質(zhì)，清除氧化物質(zhì)，消除腐敗，抑制水中的病原菌，形成適于動(dòng)植物生長的良好環(huán)境。同時(shí)，它還產(chǎn)生大量易為動(dòng)植物吸收的有益物質(zhì)，凈化養(yǎng)殖池中的排泄物和殘餌，改善水質(zhì)，減少魚病[4]。EM具有無毒副作用、無耐藥性、無殘留、低成本、效果顯著等特點(diǎn)，有效地克服抗生素、激素、防腐劑、農(nóng)藥、化肥等化學(xué)農(nóng)業(yè)所產(chǎn)生的種種副作用。使用微生態(tài)制劑是實(shí)施水產(chǎn)健康養(yǎng)殖的一項(xiàng)重要技術(shù)手段[5]。

本實(shí)驗(yàn)首先分離鑒定魚體和養(yǎng)殖水體中的致病性嗜水氣單胞菌，在此基礎(chǔ)上，研究EM對致病性嗜水氣單胞菌的抑制作用，為今后EM在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

病料:取自江西某水產(chǎn)養(yǎng)殖場的病魚和養(yǎng)殖水。細(xì)菌微量生化反應(yīng)管:購自杭州天和微生物試劑有限公司。藥敏試紙:購自杭州天和微生物試劑有限公司。EM:購自江西省天意生物技術(shù)開發(fā)有限公司。嗜水氣單胞菌16S rDNA和Aero基因的特異性擴(kuò)增引物:由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基:購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。牛津杯:內(nèi)徑為8 mm。

1.2 方法

1.2.1 嗜水氣單胞菌的分離 無菌操作取病魚肌肉接種普通瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。將養(yǎng)殖水涂布胰蛋白酶瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2 分離菌純化培養(yǎng) 挑選形態(tài)一致的疑似菌落，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，劃線接種普通瓊脂培養(yǎng)基純化，37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.3 分離菌株分子生物學(xué)檢測 按照李紹戊等[6]方法，對分離菌株進(jìn)行嗜水氣單胞菌的保守基因16S rDNA基因及特異性Aero基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工測序。

1.2.4 嗜水氣單胞菌生長曲線圖繪制 選取一株嗜水氣單胞菌分離株，無菌操作接種10支普通肉湯，37℃ 160 r/min振蕩培養(yǎng)。相隔一定時(shí)間定期取樣，測定每份樣品的OD630值，以O(shè)D630值為縱坐標(biāo)、培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長曲線圖。

1.2.5 藥敏實(shí)驗(yàn) 將分離菌分別接種普通肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，按瓊脂擴(kuò)散法用14種抗生素做藥敏實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 EM體外抑制實(shí)驗(yàn) 將分離菌株肉湯培養(yǎng)物均勻涂布普通瓊脂培養(yǎng)基，將不同濃度的EM小心滴入牛津杯內(nèi)，37℃培養(yǎng)24 h，分別測量抑菌圈大小。

2 結(jié)果和分析

2.1 嗜水氣單胞菌分離結(jié)果

從病魚肌肉和水體中共分離純化到14株細(xì)菌，在普通營養(yǎng)瓊脂平板上形成表面光滑、隆起、濕潤的乳白色菌落，在胰蛋白酶瓊脂培養(yǎng)基形成透明溶蛋白圈的中等大小菌落，菌體均為革蘭氏陰性桿菌。

2.2 分離菌株分子生物學(xué)檢測結(jié)果

14株分離菌株均擴(kuò)增到嗜水氣單胞菌16S rDNA，其中7株擴(kuò)增到氣溶素基因(Aero基因)。與Gen-Bank已經(jīng)登錄的嗜水氣單胞菌16S rDNA和氣溶素基因之間的同源性分別為97.9% ～100% 和97.1% ～100%。因此，可確定14株分離菌均為嗜水氣單胞菌，其中7株為攜帶氣溶素基因的分離菌株為致病性嗜水氣單胞菌。

2.3 分離菌株生長曲線

Jxg－1株生長曲線(圖1)表明，在本試驗(yàn)條件下嗜水氣單胞菌培養(yǎng)21 h后進(jìn)行停滯期。因此，本試驗(yàn)以18 h的細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

圖1 分離菌株Jxg－1的生長曲線Fig.1 The growth curve of Aeromonas hydrophila isolate Jxg－1

2.4 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果見表1。本試驗(yàn)的嗜水氣單胞菌分離株對部分藥物呈現(xiàn)一致的耐藥性，14株菌對青霉素G、氨芐西林、頭孢拉定、頭孢唑啉、四環(huán)素、甲氧嘧啶、林可霉素、頭孢氨芐均耐藥;對頭孢噻肟和呋喃唑酮表現(xiàn)高度敏感;對強(qiáng)力霉素、頭孢砒肟、大觀霉素、乙酰螺旋霉素的耐藥性表現(xiàn)不一。

表1 嗜水氣單胞菌分離菌株對14種抗生素的耐藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Drug risistance test of 14 Aeromonas hydrophila isolates cm

2.5 EM體外抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果

EM對14株嗜水氣單胞菌的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果見表2，結(jié)果表明:EM對嗜水氣單胞菌的體外抑制作用與濃度呈正相關(guān)，濃度大于60%則對14株菌種均有抑制作用，濃度越大，抑菌圈越大。

3 結(jié)論與討論

嗜水氣單胞菌廣泛存在于淡水、污水、淤泥及土壤中，如水體中的營養(yǎng)豐富、水溫適宜，致病性嗜水氣單胞菌大量增殖，可導(dǎo)致大量魚發(fā)病。本試驗(yàn)從病魚和水體中共分離到14株分泌蛋白酶的細(xì)菌，通過16S rDNA基因的擴(kuò)增和測序列證明均為嗜水氣單胞菌，通過對嗜水氣單胞菌氣溶素基因(Aero基因)的擴(kuò)增表明其中的7株為致病性嗜水氣單胞菌[7]。從病魚和水體中分離到的致病性嗜水氣單胞菌的生化特性和對藥物的敏感性基本一致，且部分菌株的16S rDNA基因和Aero基因的同源性為100%，表明病魚的嗜水氣單胞菌是通過水體感染。

本試驗(yàn)分離的嗜水氣單胞菌均對青霉素、阿莫西林、頭孢類抗生素表現(xiàn)耐藥，對其他抗菌藥藥物也表現(xiàn)不同程度的耐藥性，與之前的文獻(xiàn)報(bào)道一致[8－11]，如果水產(chǎn)養(yǎng)殖中長期使用抗菌藥物，則耐藥譜會越來越廣。EM是一種復(fù)合微生物菌劑，它由光合細(xì)菌、乳酸菌、放線菌等10個(gè)屬80多種微生物復(fù)合培養(yǎng)而成，具有促進(jìn)動(dòng)、植物生長，去除糞便惡臭，改善生態(tài)環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體的抗病力和免疫力等功效。因此，EM應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，具有凈化水質(zhì)、促進(jìn)生長、提高成活率、減少病原菌的作用[12－15]，因此可減少水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗菌藥物的使用。本試驗(yàn)通過EM對嗜水氣單胞菌的體外抑菌作用進(jìn)行測定，結(jié)果表明EM在體外具有抑制嗜水氣單胞菌增殖的作用，抑菌作用與濃度呈正相關(guān)，但其對嗜水氣單胞菌的抑菌機(jī)理及抑菌成分仍不完全清楚，有待進(jìn)一步研究。

表2 不同濃度EM對分離菌體外抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Antibacterial effect in vitro of different dilution EM on Aeromonas hydrophila cm

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