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    基于SSR和SCAR標(biāo)記的草莓主栽品種指紋圖譜構(gòu)建及親緣關(guān)系分析

    2013-08-27 07:10:00阮松林馬華升王淑珍方獻(xiàn)平肖文斐吳根良
    關(guān)鍵詞:主栽親緣指紋

    忻 雅,阮松林,馬華升,王淑珍,方獻(xiàn)平,肖文斐,吳根良

    (杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江 杭州 310024)

    草莓有“水果皇后”之美譽(yù),不僅有獨(dú)特的口味還有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。我國(guó)是草莓的主要生產(chǎn)國(guó),種植面積和產(chǎn)量位居世界前列。隨著社會(huì)的進(jìn)步、技術(shù)的發(fā)展,僅依靠簡(jiǎn)單遺傳模式的傳統(tǒng)草莓育種技術(shù)已不能完全滿(mǎn)足市場(chǎng)對(duì)草莓色、香、味、營(yíng)養(yǎng)、安全等方面的要求,而這一需求可能隨著分子生物學(xué)在動(dòng)植物新品種選育及改良上的廣泛應(yīng)用逐漸得到解決。但栽培草莓(鳳梨草莓,F(xiàn)ragaria ananassa Duch.)為高度雜合的八倍體,與其它園藝植物如番茄、葡萄、柑橘相比,草莓基因組學(xué)和生理生化方面的研究極其缺乏,極少數(shù)報(bào)道提供了部分基因序列,但沒(méi)有揭示關(guān)鍵過(guò)程的分子機(jī)制,所以有關(guān)草莓分子生物學(xué)方面的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足其育種需求[1]。

    目前,我國(guó)生產(chǎn)上主栽品種多引自國(guó)外,近年來(lái)隨著栽培品種數(shù)量增加、不同地區(qū)之間頻繁引種以及草莓本身的營(yíng)養(yǎng)繁殖特性,使得品種名稱(chēng)十分混亂。這對(duì)草莓栽培品種的鑒定提出了更高要求,以前主要是利用形態(tài)標(biāo)記鑒定草莓品種,而20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記比形態(tài)標(biāo)記具有多方面的優(yōu)越性。日本有通過(guò)DNA鑒定技術(shù)保護(hù)本國(guó)草莓的方法[2],其他國(guó)家較多的運(yùn)用RAPD標(biāo)記進(jìn)行草莓品種鑒定[3-5],國(guó)內(nèi)最近的報(bào)道是用AFLP標(biāo)記進(jìn)行草莓品種的遺傳關(guān)系分析[6],利用GISH和RAPD進(jìn)行種間雜種的檢測(cè)[7],利用RAPD和SCAR標(biāo)記對(duì)32份草莓材料進(jìn)行鑒定[8]。但研究表明RAPD標(biāo)記對(duì)實(shí)驗(yàn)條件敏感,可重復(fù)性較差,為此,國(guó)外已開(kāi)始把穩(wěn)定高效的SSR標(biāo)記應(yīng)用于草莓品種鑒定[9-10],而國(guó)內(nèi)鮮有這方面的報(bào)道。本文利用已有的各種分子標(biāo)記對(duì)南方現(xiàn)有草莓品種資源進(jìn)行徹查,篩選高效標(biāo)記構(gòu)建指紋圖譜并進(jìn)行親緣關(guān)系分析,以便為快速準(zhǔn)確鑒定草莓品種提供技術(shù)支撐,對(duì)自有品種進(jìn)行有效保護(hù),同時(shí)顯著加快雜交育種的進(jìn)程。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    17個(gè)南方主栽品種(表1)中除了紅實(shí)美、石莓四號(hào)和03-6-2為我國(guó)培育品種,其它都為國(guó)外引進(jìn)品種。其中紅頰、豐香和章姬來(lái)自杭州市農(nóng)科院草莓圃,其他14個(gè)均由浙江省農(nóng)科院蔣桂華老師提供。為比較各品種間的親緣關(guān)系,本文也同時(shí)對(duì)杭州市農(nóng)科院引進(jìn)的9個(gè)德國(guó)品種進(jìn)行了比較研究。取新鮮嫩葉用液氮迅速冷凍處理,然后保存在-80℃冰箱中備用。草莓葉片總DNA提取采用改進(jìn)的CTAB 法[11]。

    1.2 方法

    1.2.1 引物合成 參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)了8個(gè)RAPD引物[8]、6對(duì)SCAR引物[8]和10對(duì) EST-SSR 引物[9],分別編號(hào)為R1~8、S1~6和E1~10,由上海生工生物技術(shù)公司合成。

    1.2.2 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè) PCR擴(kuò)增在MG96+型PCR儀上進(jìn)行,反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同樣參考上述參考文獻(xiàn)[8-9]。RAPD、SCAR引物擴(kuò)增以DNA marker DL2000為分子量標(biāo)記,EST-SSR引物擴(kuò)增以GeneRuler 100 bp作為分子量標(biāo)記,分別用15 g/L瓊脂糖凝膠和8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳后進(jìn)行常規(guī)銀染。在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc XR和Bio-Rad GS-800掃描儀上成相。

    1.3 數(shù)據(jù)分析

    選取帶型穩(wěn)定、主帶明顯、影子帶少、多態(tài)性信息含量較大的引物,確定為構(gòu)建指紋圖譜的核心標(biāo)記引物。利用人工方法讀數(shù),將每個(gè)核心標(biāo)記引物擴(kuò)增的各個(gè)等位點(diǎn)主帶型按遷移率由快到慢的順序編號(hào),按主帶型的有無(wú)分別記為1、0,由核心標(biāo)記引物擴(kuò)增的主帶型記錄結(jié)果組合表示品種的指紋圖譜。利用軟件NTSYS-pc估算相似系數(shù),采用UPGMA分析程序,繪制親緣關(guān)系樹(shù)狀圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 標(biāo)記多態(tài)性分析

    圖1 RAPD標(biāo)記對(duì)13個(gè)草莓品種的多態(tài)性擴(kuò)增Fig.1 Amplification products obtained from isolates using marker R6 in 13 cultivars.

    24個(gè)引物對(duì)地域來(lái)源不同的Tenira與紅頰DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn),取能擴(kuò)增出產(chǎn)物的引物對(duì)所有26個(gè)DNA進(jìn)行擴(kuò)增,分析其多態(tài)性。結(jié)果,24個(gè)引物中,除了引物S4和S5,有22個(gè)能對(duì)Tenira與紅頰基因組DNA擴(kuò)增出產(chǎn)物,引物可用率達(dá)到91.7%。除了引物R1、R2、R5和E1,其余18個(gè)引物表現(xiàn)出多態(tài)性,多態(tài)性引物占可用引物的81.8%。圖1、2、3 分別為 RAPD 引物 R6、SCAR 引物(S1、S3)、EST-SSR 引物(E2、E3、E4、E7、E8)對(duì)不同草莓品種的多態(tài)性擴(kuò)增。

    圖2 SCAR標(biāo)記對(duì)26個(gè)草莓品種的多態(tài)性擴(kuò)增Fig.2 Amplification products obtained from isolates using SCAR markers in 26 cultivars.

    圖3 EST-SSR標(biāo)記對(duì)26個(gè)草莓品種的多態(tài)性擴(kuò)增Fig.3 Amplification products obtained from isolates using EST-SSR markers in 26 cultivars.

    2.2 草莓指紋圖譜的建立

    上圖中除RAPD引物外的其它7對(duì)引物帶型穩(wěn)定、多態(tài)性信息含量相對(duì)較大,被確定為構(gòu)建指紋圖譜的核心標(biāo)記引物。根據(jù)核心引物的擴(kuò)增情況,對(duì)它們?cè)?6個(gè)品種中擴(kuò)增的多態(tài)性帶型進(jìn)行總結(jié),標(biāo)記 A-G 分別有4、11、5、7、4、2、2 種帶型(圖4)。

    圖4 7個(gè)核心標(biāo)記在26個(gè)品種中擴(kuò)增的多態(tài)性帶型Fig.4 Polymorphic band types obtained from isolates using 7 core markers in 26 cultivars

    根據(jù)擴(kuò)增及計(jì)算結(jié)果,26個(gè)品種的指紋圖譜見(jiàn)表1。由表1可知,7個(gè)標(biāo)記的引物擴(kuò)增帶型能形成Gento、Tenira、Rimona、aroma、bellarosse、Kletter、Ferma、佐賀清香、寶交早生、童子一號(hào)、法蘭第、花姬、紅實(shí)美、章姬、紅頰、豐香、千禧、櫪乙女、石莓四號(hào)、03-6-2和海玉這21個(gè)品種的特異指紋圖譜,使它們相互區(qū)分。作為自有品種的03-6-2,如果在今后進(jìn)行大面積推廣應(yīng)用,完全可以用指紋圖譜進(jìn)行品種保護(hù)。

    由表1還可看出,達(dá)塞、弗吉尼亞和鬼怒甘,Elvira和Stugarta的指紋圖譜相同,這7個(gè)標(biāo)記引物擴(kuò)增的帶型組合仍然不能使它們相互區(qū)分。

    表1 26份草莓資源的名稱(chēng)、來(lái)源和特征指紋代碼Tab.1 Name ,origin and fingerprinting code of 26 strawberry Germplasm

    2.3 親緣關(guān)系分析

    將每個(gè)核心標(biāo)記引物擴(kuò)增帶型的1、0數(shù)據(jù),制成Excel文件用于聚類(lèi)分析。使用NTSYS-pc軟件估算相似系數(shù),采用UPGMA分析程序,繪制親緣關(guān)系樹(shù)狀圖(圖5)。

    圖5 26個(gè)草莓品種的分子標(biāo)記聚類(lèi)圖Fig.5 Dendrogram of 26 strawberry cultivars

    由圖5可以看出,26個(gè)草莓品種在相似系數(shù)0.63處可以分為4個(gè)主要類(lèi)群,南方主栽引進(jìn)品種為一個(gè)類(lèi)群(除Gento),德國(guó)品種分3個(gè)類(lèi)群。從相似系數(shù)表看出,8個(gè)德國(guó)品種中親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是aroma和bellarosse為0.32,最近的是Elvira和Stugarta為1,平均相似系數(shù)為0.58。南方主栽引進(jìn)品種相似系數(shù)最遠(yuǎn)的是03-6-2分別與豐香和海玉為0.59,最近的是達(dá)塞和弗吉尼亞和鬼怒甘為1,平均相似系數(shù)為0.79,遠(yuǎn)高于德國(guó)引進(jìn)品種的平均相似系數(shù)。這說(shuō)明南方主栽引進(jìn)品種的親緣關(guān)系較近,主要原因可能是日本草莓品種雜交親本重疊較多,比如,章姬為紅實(shí)美、紅頰的親本之一,寶交早生為石莓四號(hào)的親本之一,雜交種與親本的相似系數(shù)都高達(dá)0.86,女峰為章姬的親本之一,而鬼怒甘從女峰變異株中選出,相似系數(shù)高達(dá)0.96。弗吉尼亞為紅實(shí)美的親本之一,它們的相似系數(shù)為0.82。而達(dá)塞、弗吉尼亞與章姬,花姬與紅頰,紅實(shí)美與櫪乙女,佐賀清香與童子一號(hào),它們的相似系數(shù)也都達(dá)到了0.96,其遺傳關(guān)系因?yàn)槟承┢贩N的親本來(lái)源不明而不甚清楚。Elvira和Stugarta不能區(qū)分,達(dá)塞、弗吉尼亞和鬼怒甘不能區(qū)分,它們極有可能是同種異名的草莓品種。千禧與櫪乙女為同種異名的品種,但實(shí)驗(yàn)結(jié)果它們的相似系數(shù)為0.86而非1。這些都有待于進(jìn)一步的研究,比如材料的進(jìn)一步確定和標(biāo)記數(shù)目的增加等。其它品種在一定相似水平上可以相互區(qū)分,此結(jié)果與指紋圖譜結(jié)果完全吻合。

    有些品種雖然不屬于同一個(gè)地區(qū),但是親緣關(guān)系卻很近,如Gento與南方主栽引進(jìn)品種的親緣關(guān)系比它與德國(guó)品種更近,與03-6-2達(dá)到了0.86。相反,有些品種雖然屬于同一地區(qū),但是親緣關(guān)系卻很遠(yuǎn),如同為日本品種的佐賀清香與鬼怒甘,寶交早生、章姬與千禧,豐香、海玉與紅頰,相似系數(shù)只為0.68。造成這種現(xiàn)象的原因有很多,比如頻繁的異地引種、品種之間具有共同的親本、生長(zhǎng)條件和自然選擇條件相仿等,可能由上述一種或多種因素共同作用而致。

    3 討論

    常規(guī)的草莓品種鑒定經(jīng)常通過(guò)外觀形態(tài)觀察來(lái)進(jìn)行,往往鑒定周期長(zhǎng),誤差較大,一些性狀差異小的品種更是難以鑒定。我國(guó)南方主栽的草莓品種多引自國(guó)外,特別在近幾年草莓種植業(yè)飛速發(fā)展的背景下,引種的力度更是增強(qiáng)。這也導(dǎo)致目前某些引進(jìn)品種存在同種異名的現(xiàn)象,造成引進(jìn)和品種利用時(shí)嚴(yán)重的人力物力浪費(fèi)。DNA分子標(biāo)記反映的是遺傳本質(zhì)上的差異,用于品種鑒定時(shí)具有周期短,不受環(huán)境條件的影響,真實(shí)可靠等優(yōu)點(diǎn)。本文首次利用分子標(biāo)記構(gòu)建了紅頰、章姬、豐香等14個(gè)南方優(yōu)質(zhì)主栽品種和7個(gè)德國(guó)新引進(jìn)品種的指紋圖譜,使它們完全區(qū)分。并對(duì)26個(gè)草莓品種親緣關(guān)系分析,為目前已經(jīng)趨于混亂的南方引進(jìn)和主栽草莓品種的鑒定提供有效的技術(shù)支撐。隨著品種數(shù)量的進(jìn)一步增加,這7個(gè)引物組合的鑒別能力會(huì)逐漸減低,但可以根據(jù)實(shí)際檢測(cè)情況增加引物組合的數(shù)量。此外,利用分子標(biāo)記技術(shù)確定作為親本的品種間的遺傳距離,指導(dǎo)雜交育種親本選配,為提高育種效率提供理論依據(jù)。

    本文所用的RAPD標(biāo)記一直得不到穩(wěn)定擴(kuò)增結(jié)果,可靠性較差,決定了它不適合用于指紋圖譜的構(gòu)建。擴(kuò)增結(jié)果較穩(wěn)定的EST-SSR標(biāo)記和SCAR標(biāo)記成了本研究的主要工具,但本文所用引物來(lái)源于已開(kāi)發(fā)的標(biāo)記,數(shù)量較少,而且多態(tài)性極高的標(biāo)記更少。本文沒(méi)有區(qū)分出的鬼怒甘和弗吉尼亞品種,利用AFLP標(biāo)記進(jìn)行分析[6],雖然親緣關(guān)系非常接近,但還是能區(qū)分出來(lái)。因此說(shuō)明本文所用的SSR標(biāo)記數(shù)目不夠多,而目前常用的從公共數(shù)據(jù)庫(kù)EST序列中篩選并建立EST-SSR標(biāo)記的技術(shù),為本研究的進(jìn)一步深入提供了快速經(jīng)濟(jì)的有效方法。

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