基于SSR和SCAR標(biāo)記的草莓主栽品種指紋圖譜構(gòu)建及親緣關(guān)系分析

忻 雅，阮松林，馬華升，王淑珍，方獻(xiàn)平，肖文斐，吳根良

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024)

草莓有“水果皇后”之美譽(yù)，不僅有獨(dú)特的口味還有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。我國(guó)是草莓的主要生產(chǎn)國(guó)，種植面積和產(chǎn)量位居世界前列。隨著社會(huì)的進(jìn)步、技術(shù)的發(fā)展，僅依靠簡(jiǎn)單遺傳模式的傳統(tǒng)草莓育種技術(shù)已不能完全滿(mǎn)足市場(chǎng)對(duì)草莓色、香、味、營(yíng)養(yǎng)、安全等方面的要求，而這一需求可能隨著分子生物學(xué)在動(dòng)植物新品種選育及改良上的廣泛應(yīng)用逐漸得到解決。但栽培草莓(鳳梨草莓，F(xiàn)ragaria ananassa Duch.)為高度雜合的八倍體，與其它園藝植物如番茄、葡萄、柑橘相比，草莓基因組學(xué)和生理生化方面的研究極其缺乏，極少數(shù)報(bào)道提供了部分基因序列，但沒(méi)有揭示關(guān)鍵過(guò)程的分子機(jī)制，所以有關(guān)草莓分子生物學(xué)方面的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足其育種需求[1]。

目前，我國(guó)生產(chǎn)上主栽品種多引自國(guó)外，近年來(lái)隨著栽培品種數(shù)量增加、不同地區(qū)之間頻繁引種以及草莓本身的營(yíng)養(yǎng)繁殖特性，使得品種名稱(chēng)十分混亂。這對(duì)草莓栽培品種的鑒定提出了更高要求，以前主要是利用形態(tài)標(biāo)記鑒定草莓品種，而20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記比形態(tài)標(biāo)記具有多方面的優(yōu)越性。日本有通過(guò)DNA鑒定技術(shù)保護(hù)本國(guó)草莓的方法[2]，其他國(guó)家較多的運(yùn)用RAPD標(biāo)記進(jìn)行草莓品種鑒定[3-5]，國(guó)內(nèi)最近的報(bào)道是用AFLP標(biāo)記進(jìn)行草莓品種的遺傳關(guān)系分析[6]，利用GISH和RAPD進(jìn)行種間雜種的檢測(cè)[7]，利用RAPD和SCAR標(biāo)記對(duì)32份草莓材料進(jìn)行鑒定[8]。但研究表明RAPD標(biāo)記對(duì)實(shí)驗(yàn)條件敏感，可重復(fù)性較差，為此，國(guó)外已開(kāi)始把穩(wěn)定高效的SSR標(biāo)記應(yīng)用于草莓品種鑒定[9-10]，而國(guó)內(nèi)鮮有這方面的報(bào)道。本文利用已有的各種分子標(biāo)記對(duì)南方現(xiàn)有草莓品種資源進(jìn)行徹查，篩選高效標(biāo)記構(gòu)建指紋圖譜并進(jìn)行親緣關(guān)系分析，以便為快速準(zhǔn)確鑒定草莓品種提供技術(shù)支撐，對(duì)自有品種進(jìn)行有效保護(hù)，同時(shí)顯著加快雜交育種的進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 材料

17個(gè)南方主栽品種(表1)中除了紅實(shí)美、石莓四號(hào)和03-6-2為我國(guó)培育品種，其它都為國(guó)外引進(jìn)品種。其中紅頰、豐香和章姬來(lái)自杭州市農(nóng)科院草莓圃，其他14個(gè)均由浙江省農(nóng)科院蔣桂華老師提供。為比較各品種間的親緣關(guān)系，本文也同時(shí)對(duì)杭州市農(nóng)科院引進(jìn)的9個(gè)德國(guó)品種進(jìn)行了比較研究。取新鮮嫩葉用液氮迅速冷凍處理，然后保存在-80℃冰箱中備用。草莓葉片總DNA提取采用改進(jìn)的CTAB 法[11]。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)了8個(gè)RAPD引物[8]、6對(duì)SCAR引物[8]和10對(duì) EST-SSR 引物[9]，分別編號(hào)為R1～8、S1～6和E1～10，由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.2.2 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè) PCR擴(kuò)增在MG96+型PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同樣參考上述參考文獻(xiàn)[8-9]。RAPD、SCAR引物擴(kuò)增以DNA marker DL2000為分子量標(biāo)記，EST-SSR引物擴(kuò)增以GeneRuler 100 bp作為分子量標(biāo)記，分別用15 g/L瓊脂糖凝膠和8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳后進(jìn)行常規(guī)銀染。在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc XR和Bio-Rad GS-800掃描儀上成相。

1.3 數(shù)據(jù)分析

選取帶型穩(wěn)定、主帶明顯、影子帶少、多態(tài)性信息含量較大的引物，確定為構(gòu)建指紋圖譜的核心標(biāo)記引物。利用人工方法讀數(shù)，將每個(gè)核心標(biāo)記引物擴(kuò)增的各個(gè)等位點(diǎn)主帶型按遷移率由快到慢的順序編號(hào)，按主帶型的有無(wú)分別記為1、0，由核心標(biāo)記引物擴(kuò)增的主帶型記錄結(jié)果組合表示品種的指紋圖譜。利用軟件NTSYS-pc估算相似系數(shù)，采用UPGMA分析程序，繪制親緣關(guān)系樹(shù)狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)記多態(tài)性分析

圖1 RAPD標(biāo)記對(duì)13個(gè)草莓品種的多態(tài)性擴(kuò)增Fig.1 Amplification products obtained from isolates using marker R6 in 13 cultivars.

24個(gè)引物對(duì)地域來(lái)源不同的Tenira與紅頰DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)，取能擴(kuò)增出產(chǎn)物的引物對(duì)所有26個(gè)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，分析其多態(tài)性。結(jié)果，24個(gè)引物中，除了引物S4和S5，有22個(gè)能對(duì)Tenira與紅頰基因組DNA擴(kuò)增出產(chǎn)物，引物可用率達(dá)到91.7%。除了引物R1、R2、R5和E1，其余18個(gè)引物表現(xiàn)出多態(tài)性，多態(tài)性引物占可用引物的81.8%。圖1、2、3 分別為 RAPD 引物 R6、SCAR 引物(S1、S3)、EST-SSR 引物(E2、E3、E4、E7、E8)對(duì)不同草莓品種的多態(tài)性擴(kuò)增。

圖2 SCAR標(biāo)記對(duì)26個(gè)草莓品種的多態(tài)性擴(kuò)增Fig.2 Amplification products obtained from isolates using SCAR markers in 26 cultivars.

圖3 EST-SSR標(biāo)記對(duì)26個(gè)草莓品種的多態(tài)性擴(kuò)增Fig.3 Amplification products obtained from isolates using EST-SSR markers in 26 cultivars.

2.2 草莓指紋圖譜的建立

上圖中除RAPD引物外的其它7對(duì)引物帶型穩(wěn)定、多態(tài)性信息含量相對(duì)較大，被確定為構(gòu)建指紋圖譜的核心標(biāo)記引物。根據(jù)核心引物的擴(kuò)增情況，對(duì)它們?cè)?6個(gè)品種中擴(kuò)增的多態(tài)性帶型進(jìn)行總結(jié)，標(biāo)記 A-G 分別有4、11、5、7、4、2、2 種帶型(圖4)。

圖4 7個(gè)核心標(biāo)記在26個(gè)品種中擴(kuò)增的多態(tài)性帶型Fig.4 Polymorphic band types obtained from isolates using 7 core markers in 26 cultivars

根據(jù)擴(kuò)增及計(jì)算結(jié)果，26個(gè)品種的指紋圖譜見(jiàn)表1。由表1可知，7個(gè)標(biāo)記的引物擴(kuò)增帶型能形成Gento、Tenira、Rimona、aroma、bellarosse、Kletter、Ferma、佐賀清香、寶交早生、童子一號(hào)、法蘭第、花姬、紅實(shí)美、章姬、紅頰、豐香、千禧、櫪乙女、石莓四號(hào)、03-6-2和海玉這21個(gè)品種的特異指紋圖譜，使它們相互區(qū)分。作為自有品種的03-6-2，如果在今后進(jìn)行大面積推廣應(yīng)用，完全可以用指紋圖譜進(jìn)行品種保護(hù)。

由表1還可看出，達(dá)塞、弗吉尼亞和鬼怒甘，Elvira和Stugarta的指紋圖譜相同，這7個(gè)標(biāo)記引物擴(kuò)增的帶型組合仍然不能使它們相互區(qū)分。

表1 26份草莓資源的名稱(chēng)、來(lái)源和特征指紋代碼Tab.1 Name ，origin and fingerprinting code of 26 strawberry Germplasm

2.3 親緣關(guān)系分析

將每個(gè)核心標(biāo)記引物擴(kuò)增帶型的1、0數(shù)據(jù)，制成Excel文件用于聚類(lèi)分析。使用NTSYS-pc軟件估算相似系數(shù)，采用UPGMA分析程序，繪制親緣關(guān)系樹(shù)狀圖(圖5)。

圖5 26個(gè)草莓品種的分子標(biāo)記聚類(lèi)圖Fig.5 Dendrogram of 26 strawberry cultivars

由圖5可以看出，26個(gè)草莓品種在相似系數(shù)0.63處可以分為4個(gè)主要類(lèi)群，南方主栽引進(jìn)品種為一個(gè)類(lèi)群(除Gento)，德國(guó)品種分3個(gè)類(lèi)群。從相似系數(shù)表看出，8個(gè)德國(guó)品種中親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是aroma和bellarosse為0.32，最近的是Elvira和Stugarta為1，平均相似系數(shù)為0.58。南方主栽引進(jìn)品種相似系數(shù)最遠(yuǎn)的是03-6-2分別與豐香和海玉為0.59，最近的是達(dá)塞和弗吉尼亞和鬼怒甘為1，平均相似系數(shù)為0.79，遠(yuǎn)高于德國(guó)引進(jìn)品種的平均相似系數(shù)。這說(shuō)明南方主栽引進(jìn)品種的親緣關(guān)系較近，主要原因可能是日本草莓品種雜交親本重疊較多，比如，章姬為紅實(shí)美、紅頰的親本之一，寶交早生為石莓四號(hào)的親本之一，雜交種與親本的相似系數(shù)都高達(dá)0.86，女峰為章姬的親本之一，而鬼怒甘從女峰變異株中選出，相似系數(shù)高達(dá)0.96。弗吉尼亞為紅實(shí)美的親本之一，它們的相似系數(shù)為0.82。而達(dá)塞、弗吉尼亞與章姬，花姬與紅頰，紅實(shí)美與櫪乙女，佐賀清香與童子一號(hào)，它們的相似系數(shù)也都達(dá)到了0.96，其遺傳關(guān)系因?yàn)槟承┢贩N的親本來(lái)源不明而不甚清楚。Elvira和Stugarta不能區(qū)分，達(dá)塞、弗吉尼亞和鬼怒甘不能區(qū)分，它們極有可能是同種異名的草莓品種。千禧與櫪乙女為同種異名的品種，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果它們的相似系數(shù)為0.86而非1。這些都有待于進(jìn)一步的研究，比如材料的進(jìn)一步確定和標(biāo)記數(shù)目的增加等。其它品種在一定相似水平上可以相互區(qū)分，此結(jié)果與指紋圖譜結(jié)果完全吻合。

有些品種雖然不屬于同一個(gè)地區(qū)，但是親緣關(guān)系卻很近，如Gento與南方主栽引進(jìn)品種的親緣關(guān)系比它與德國(guó)品種更近，與03-6-2達(dá)到了0.86。相反，有些品種雖然屬于同一地區(qū)，但是親緣關(guān)系卻很遠(yuǎn)，如同為日本品種的佐賀清香與鬼怒甘，寶交早生、章姬與千禧，豐香、海玉與紅頰，相似系數(shù)只為0.68。造成這種現(xiàn)象的原因有很多，比如頻繁的異地引種、品種之間具有共同的親本、生長(zhǎng)條件和自然選擇條件相仿等，可能由上述一種或多種因素共同作用而致。

3 討論

常規(guī)的草莓品種鑒定經(jīng)常通過(guò)外觀形態(tài)觀察來(lái)進(jìn)行，往往鑒定周期長(zhǎng)，誤差較大，一些性狀差異小的品種更是難以鑒定。我國(guó)南方主栽的草莓品種多引自國(guó)外，特別在近幾年草莓種植業(yè)飛速發(fā)展的背景下，引種的力度更是增強(qiáng)。這也導(dǎo)致目前某些引進(jìn)品種存在同種異名的現(xiàn)象，造成引進(jìn)和品種利用時(shí)嚴(yán)重的人力物力浪費(fèi)。DNA分子標(biāo)記反映的是遺傳本質(zhì)上的差異，用于品種鑒定時(shí)具有周期短，不受環(huán)境條件的影響，真實(shí)可靠等優(yōu)點(diǎn)。本文首次利用分子標(biāo)記構(gòu)建了紅頰、章姬、豐香等14個(gè)南方優(yōu)質(zhì)主栽品種和7個(gè)德國(guó)新引進(jìn)品種的指紋圖譜，使它們完全區(qū)分。并對(duì)26個(gè)草莓品種親緣關(guān)系分析，為目前已經(jīng)趨于混亂的南方引進(jìn)和主栽草莓品種的鑒定提供有效的技術(shù)支撐。隨著品種數(shù)量的進(jìn)一步增加，這7個(gè)引物組合的鑒別能力會(huì)逐漸減低，但可以根據(jù)實(shí)際檢測(cè)情況增加引物組合的數(shù)量。此外，利用分子標(biāo)記技術(shù)確定作為親本的品種間的遺傳距離，指導(dǎo)雜交育種親本選配，為提高育種效率提供理論依據(jù)。

本文所用的RAPD標(biāo)記一直得不到穩(wěn)定擴(kuò)增結(jié)果，可靠性較差，決定了它不適合用于指紋圖譜的構(gòu)建。擴(kuò)增結(jié)果較穩(wěn)定的EST-SSR標(biāo)記和SCAR標(biāo)記成了本研究的主要工具，但本文所用引物來(lái)源于已開(kāi)發(fā)的標(biāo)記，數(shù)量較少，而且多態(tài)性極高的標(biāo)記更少。本文沒(méi)有區(qū)分出的鬼怒甘和弗吉尼亞品種，利用AFLP標(biāo)記進(jìn)行分析[6]，雖然親緣關(guān)系非常接近，但還是能區(qū)分出來(lái)。因此說(shuō)明本文所用的SSR標(biāo)記數(shù)目不夠多，而目前常用的從公共數(shù)據(jù)庫(kù)EST序列中篩選并建立EST-SSR標(biāo)記的技術(shù)，為本研究的進(jìn)一步深入提供了快速經(jīng)濟(jì)的有效方法。

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