不同治療條件下對仔兔大腸桿菌病腸道顯微結(jié)構(gòu)的影響

劉蓮蓮，張應龍，楊?，?，馬衛(wèi)明 ，曹永芝

(1.山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，山東 濟南 250103;2.國家農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)代物流工程技術(shù)研究中心，山東 濟南 250103;3.山東農(nóng)業(yè)大學 動物科學與技術(shù)學院，山東 泰安 271018)

當前對大腸桿菌病的治療主要以抗生素為主，然而近年來由于抗生素濫用，耐藥菌株不斷出現(xiàn)，常用治療藥物的療效越來越差，通過研究不同治療條件下大腸桿菌對仔兔腸道顯微結(jié)構(gòu)的影響，比較常用抗生素慶大霉素和生物活性物質(zhì)乳酸菌素的治療效果，對獸醫(yī)臨床提供理論支撐，對研究大腸桿菌的致病機理有重要作用。兔大腸桿菌病又稱粘液性腸炎，是由致病性大腸桿菌及其產(chǎn)生的毒素引起的一種暴發(fā)性腸道性疾病［1］，以斷奶后不久的幼兔多發(fā)，且病程長、反復發(fā)作、死亡率高。佟承剛等［2］對腹瀉病死兔檢驗結(jié)果表明，以大腸桿菌為病因的占首位，大腸桿菌一般分為腸毒性大腸桿菌(ETEC)、非腸毒性大腸桿菌(EPEC)和侵襲性大腸桿菌(EIEC)。國內(nèi)外研究表明，只有非腸毒性大腸桿菌所致的家兔腸炎是最重要的［3－10］。絨毛和微絨毛是小腸最具特征性的結(jié)構(gòu)，是動物營養(yǎng)吸收的重要場所。小腸的絨毛長度、黏膜厚度、絨毛表面積都是衡量小腸消化吸收功能的重要指標［11］。絨毛長度、黏膜厚度增加可使小腸吸收面積擴大，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收［12，13］。絨毛和隱窩深度的比值常?？梢哉f明腸上皮細胞更新代謝的程度。兔小腸絨毛長度隨著日齡的增加而增大，腺窩深度增加，大腸桿菌等應急可使腸絨毛變短［14］。Peeters等［15］對比利時和荷蘭養(yǎng)兔場調(diào)查表明，21個兔場中的70%存在能粘附腸上皮并破壞微絨毛的大腸桿菌。腸黏膜屏障是由腸黏膜上皮細胞、腸黏液層、腸黏膜免疫系統(tǒng)、腸道正常微生物群等環(huán)節(jié)組成的復雜的防御系統(tǒng)，在阻止病原微生物入侵方面有非常重要的作用。腸黏膜上皮細胞層則是機體與內(nèi)外環(huán)境之間的第一道屏障［16］。它是將宿主的結(jié)締組織和外界環(huán)境隔離開的物理屏障。阻擋細胞旁路運輸?shù)募毎o密連接和富含肌動蛋白的微絨毛相結(jié)合在上皮細胞的頂部可以抵擋外界微生物附著和入侵。作為一個選擇性通透屏障，上皮細胞允許營養(yǎng)物質(zhì)、電解質(zhì)和水的通過，而對腸內(nèi)的毒素和抗原則保持著一種有效的抵抗。各種原因引起腹瀉的共同特點是造成腸道粘膜上皮的損傷，腸道粘膜上皮的損傷和修復是腹瀉發(fā)生的中心環(huán)節(jié)［17］。鮑國連［18］等對該病引起兔體的理化參數(shù)變化及病理特性進行了深入研究，但對該病引起腸道顯微結(jié)構(gòu)的研究國內(nèi)相對較少，本研究利用致病性大腸桿菌通過腹腔注射感染家兔，觀察不同治療條件下兔腹瀉過程中臨床癥狀、大體剖檢變化、病理組織學變化以及超微結(jié)構(gòu)的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 30～40日齡健康新西蘭兔，購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司(合格證號:0008991，許可證號:scxl魯20080002)。

1.1.2 大腸桿菌 (CICC編號:23657)，由濟南出入境檢驗檢疫局提供。

1.1.3 大腸桿菌懸液的制備 將大腸桿菌接種于高壓滅菌的肉湯中，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)28 h，活菌數(shù)達到2×109個/mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物處理及分組 40只30～40日齡新西蘭兔，體質(zhì)量為750～1000 g，室溫22～24℃飼養(yǎng)，自由進食水，光照周期為12 h/12 h，飼養(yǎng)環(huán)境安靜，通風良好。預飼1周后隨機分為4組，每組10只，第1組為正常對照組(G1)，于試驗當天腹腔注射生理鹽水2mL;第2組為大腸桿菌感染組(G2)，腹腔注射大腸桿菌培養(yǎng)液2mL;第3組為慶大霉素治療組(G3)，腹腔注射大腸桿菌培養(yǎng)液2mL，出現(xiàn)癥狀后(注射菌液后第2天)肌注慶大霉素0.5mL(2萬U/mL)∕只，連續(xù)注射3 d;第4組為乳酸菌素治療組(G4)，腹腔注射大腸桿菌培養(yǎng)液2mL，出現(xiàn)癥狀后(注射菌液后第2天)口服乳酸菌素1片(400 mg/片)，連續(xù)3 d。每日觀察家兔的臨床癥狀，人工感染后1、3、5 d各組隨機選取3只家兔剖檢，記錄剖檢變化。

1.2.2 腸道的光鏡觀察 取上述1.2.1剖檢家兔的腸管組織用4%的多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色后，光鏡觀察其組織病理學變化。

1.2.3 腸道超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察 取試驗1.2.1剖檢家兔空腸0.5 cm，生理鹽水漂洗干凈后立即放入2.5%的戊二醛中固定，PBS洗滌，1%鋨酸后固定，梯度乙醇及純乙酸乙酯脫水，臨界點干燥，噴金鍍膜后置掃描電鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 家兔臨床癥狀的變化

圖1 感染后第3天腸粘膜顯微結(jié)構(gòu)的變化Fig.1 The changes of intestine microstructure on the third day after infection

大腸桿菌感染組(G2)兔注入大腸桿菌后第1天精神沉郁，出現(xiàn)腹瀉癥狀;第2天食欲減退或廢絕，糞便粒細小、兩頭尖、成串、外有透明樣黏液;第3天有2只死亡，水瀉、糞便呈黃色或棕色，肛門附近及后腳被稀糞污染;第4天精神有所好轉(zhuǎn)，飲食量逐漸增加;第5天腹瀉癥狀減輕，家兔活動量和飲食量有所增加，第7天家兔精神良好，腹瀉癥狀消失，飲食量和活動量基本正常。慶大霉素治療組(G3)于第2天和出現(xiàn)明顯臨床癥狀，第5天基本恢復正常，未見死亡。乳酸菌素治療組(G4)第2天開始出現(xiàn)明顯癥狀，第7天基本恢復正常。對照組未出現(xiàn)腹瀉癥狀和其他臨床癥狀。

2.2 腹瀉家兔的剖檢變化

大腸桿菌感染組(G2)兔第1天肝臟、腎臟、脾臟稍有腫大，胃底部粘膜充血，十二指腸、空腸、結(jié)腸和盲腸粘膜均有不同程度的充血、出血、水腫、腸壁變薄、膀胱充盈;第3天胃膨脹，回腸內(nèi)容物呈膠樣，結(jié)腸有透明淡黃色膠樣黏液，肝臟呈暗褐色，有出血點，嚴重者腸壁呈半透明狀，腸管內(nèi)充滿黃色或褐色的稀薄內(nèi)容物;第5天剖檢變化減輕。有個別兔出現(xiàn)纖維素性肝周炎。與大腸桿菌感染組相比，慶大霉素治療組(G3)和乳酸菌素治療組(G4)剖檢變化明顯減輕，第5天基本正常，對照組剖檢未見異常。

2.3 家兔病理組織學的變化

大腸桿菌感染組(G2)第1天空腸絨毛出現(xiàn)萎縮、脫落，杯狀細胞數(shù)量增多;第3天空腸絨毛出現(xiàn)明顯萎縮、斷裂、脫落，損傷較為嚴重(圖1);第5天腸道損傷減輕。與G2組相比，G3和G4組第3天空腸絨毛損傷減輕(圖1);第5天腸道萎縮程度明顯減輕，空腸絨毛的形態(tài)和排列趨于正常。對照組腸道組織結(jié)構(gòu)正常、絨毛排列整齊、腸腺輪廓清晰。

2.4 家兔腸道超微結(jié)構(gòu)的變化

圖2 感染后第3天腸道粘膜超微變化Fig.2 The changes of intestine ultrastructure on the third day after infection

大腸桿菌感染組(G2)感染第3天空腸絨毛頂端出現(xiàn)萎縮、脫落(圖2)，微絨毛脫落，排列雜亂稀疏、紊亂(圖3)，部分上皮細胞脫落(圖4)。

與G2組相比，G3和G4組第3天空腸絨毛頂端和微絨毛的脫落現(xiàn)象減輕，損傷輕微。對照組空腸絨毛排列整齊，微絨毛分布均勻致密，排列整齊。

3 結(jié)論與討論

徐倩倩等［19］研究了白頭翁素對PRV(輪狀病毒)、E.coli(大腸桿菌)混合感染性小鼠腹瀉腸道超微結(jié)構(gòu)的影響，表明白頭翁素對輪狀病毒和大腸桿菌混合感染性腹瀉具有顯著防治功效的機制與其抵抗腸道粘膜損傷并加速粘膜修復有關(guān)，本研究表明兔引發(fā)大腸桿菌病時，生物活性物質(zhì)乳酸菌素的治療機制也與微結(jié)構(gòu)修復有關(guān)，與小鼠作用機理相同。2種藥物對兔大腸桿菌均有有效的治療作用，并且在疾病恢復期乳酸菌素的治療效果優(yōu)于慶大霉素，所以當仔兔發(fā)生大腸桿菌病時，可以嘗試使用生物活性物質(zhì)，以有利于小腸絨毛、微絨毛和上皮細胞的恢復。通過超微結(jié)構(gòu)的觀察，課題組下一步將討論不同的治療條件對腸道小腸黏膜免疫的影響，該研究對后續(xù)研究有重要意義。

圖3 感染第3天微絨毛超微變化Fig.3 The changes of Microvilli ultrastructure on the third day after infection

圖4 感染后腸道上皮細胞的超微變化Fig.4 The changes of Intestinal epithelial cells ultrastructure after infection

小腸的正常結(jié)構(gòu)與功能是營養(yǎng)物質(zhì)被充分消化與吸收的基本保證，特別是小腸的腸粘膜厚度、絨毛長度、隱窩深度及絨毛表面積是衡量小腸消化吸收功能的重要指標［20，21］，腸絨毛長度與細胞數(shù)量呈顯著相關(guān)，絨毛短時，成熟的絨毛細胞減少，對養(yǎng)分的吸收能力降低。兔小腸絨毛在病理狀態(tài)下的變化表明，大腸桿菌引起的腹瀉對小腸正常組織的形態(tài)學結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損害，引起酶水平和吸收能力的下降。隨著腸絨毛長度和粘膜厚度的恢復，病兔逐漸恢復正常［22］。從不同實驗組之間的臨床癥狀、大體剖檢變化、病理組織學變化以及超微結(jié)構(gòu)變化的差異說明慶大霉素和乳酸菌素對于大腸桿菌引起的腹瀉治療作用明顯，在疾病恢復期乳酸菌素的治療效果好于慶大霉素，所以生物活性物質(zhì)乳酸菌素對大腸桿菌引起的腹瀉有較好的治療作用，微生態(tài)制劑等其他生物活性物質(zhì)對大腸桿菌引起的腹瀉是否優(yōu)于乳酸菌素有待于進一步研究。

緊密連接是腸黏膜屏障的重要組成部分，它可以控制大分子水溶性物質(zhì)在腸上皮細胞中的自由進出。庾慶華等［23］通過大腸桿菌K88感染體外培養(yǎng)的Caco－2細胞單層模型和大鼠灌胃實驗，發(fā)現(xiàn)宿主細胞間的連接變得松散，Occludin、Claudin－1、Zo－1、E－cadherin的分布變得紊亂、表達量下降，使緊密、粘附連接遭到破壞。Zhang等［24］發(fā)現(xiàn)隨著病原性大腸桿菌的感染，緊密連接結(jié)構(gòu)受到損傷，緊密連接形態(tài)的改變伴隨著細胞旁通路的滲透性增加，導致緊密連接屏障功能的損壞。本實驗通過對感染大腸桿菌后不同時期腸道超微結(jié)構(gòu)變化發(fā)現(xiàn)與上述結(jié)果一致。通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，感染大腸桿菌后，部分上皮細胞脫落，且上皮細胞表面的微絨毛也發(fā)生大面積脫落現(xiàn)象，腸道損傷較為嚴重。杯狀細胞分泌的粘液糖蛋白可與病原微生物競爭抑制腸上皮細胞上的粘附素受體，抑制病菌在腸道的粘附定植［25］，但由于上皮細胞損傷較嚴重，這一抑制病菌在腸道粘附定值的作用大大減弱。微絨毛是細胞表面的細長指狀突起，廣泛存在于動物細胞表面，是小腸柱狀上皮細胞的細胞膜向腸腔方向形成的突起，呈細長的圓筒狀，小腸上的微絨毛使細胞的表面積擴大了30倍，大大有利于大量的吸收營養(yǎng)物質(zhì)，不論微絨毛的長度還是數(shù)量，都與細胞的代謝強度有著相應的關(guān)系。大腸桿菌其致病性主要依靠其緊密地粘附于腸上皮細胞，導致微絨毛的損傷和柱狀上皮細胞損害，造成細胞膜通透性增強，引起腸道炎癥和腹瀉、血液中白細胞增多，有大量炎性細胞侵害實質(zhì)臟器和消化道。毒素和有害物質(zhì)被吸收后，改變了腸道通透性，導致電解質(zhì)從血液中滲入消化道［26］。微絨毛的脫落使細胞與外環(huán)境的物質(zhì)交換能力減弱，不利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，細胞代謝強度減弱，大腸桿菌引起的腹瀉與絨毛、微絨毛和上皮細胞等結(jié)構(gòu)損傷與修復有關(guān)，而乳酸菌素有利于增強其修復功能。乳酸菌素對大腸桿菌引起的局部黏膜免疫是否有增強作用，有待于進一步研究。

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