RNA干擾及其在植物研究中的應(yīng)用

王婷婷 王丹丹 Rahman Laibi Chelab 康丹游騰飛 眭安平 楊星勇

（1. 西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué)圖書館，重慶 400715）

RNA干擾（RNA interference，RNAi）在20世紀(jì)90年代被發(fā)現(xiàn)，是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)同源mRNA發(fā)生特異性降解的過(guò)程［1]。RNA干擾現(xiàn)象普遍存在于真菌、果蠅、線蟲、渦蟲、植物及動(dòng)物等大多數(shù)真核生物中，它可以阻斷生物體內(nèi)特定基因的表達(dá)，從而使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，是一種在進(jìn)化上高度保守的調(diào)節(jié)機(jī)制［2]。RNA干擾現(xiàn)象自被發(fā)現(xiàn)后，迅速發(fā)展成為一種強(qiáng)大的基因沉默工具，是當(dāng)今生物學(xué)研究的一大熱點(diǎn)，現(xiàn)在對(duì)RNA干擾的作用機(jī)理和特點(diǎn)的研究已取得很大進(jìn)展。同時(shí)，對(duì)RNA干擾在植物研究上的應(yīng)用也取得豐碩成果，植物體可以利用RNA干擾來(lái)抵御病毒或者外來(lái)核酸的侵入，從而保護(hù)機(jī)體免受病毒等侵害。此外，利用RNA干擾技術(shù)可以進(jìn)行植物基因功能分析、基因表達(dá)和調(diào)控、作物品種改良和抗病蟲害等。隨著研究的不斷深入，RNA干擾將在植物學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

1 RNAi的作用機(jī)制

自從Fire等［3]發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA可以誘導(dǎo)生物體內(nèi)同源靶標(biāo)基因降解并將其命名為RNAi后，人們對(duì)RNAi進(jìn)行了大量的研究，對(duì)RNAi的作用機(jī)制也在不斷的探索當(dāng)中，目前認(rèn)為RNAi可以分為以下3個(gè)階段：起始階段、效應(yīng)階段和擴(kuò)增階段。

1.1 起始階段

dsRNA是誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生RNAi的關(guān)鍵成分，轉(zhuǎn)基因、病毒感染及轉(zhuǎn)座子活動(dòng)等都能使細(xì)胞產(chǎn)生dsRNA。這些dsRNA在內(nèi)切核酸酶，即Dicer酶的作用下加工裂解形成21-25nt的dsRNA片段，這些片段被稱為小干擾RNA（short interfering RNAs，siRNA）。Bernstein等［4]通過(guò)對(duì)果蠅進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RNAi過(guò)程中降解dsRNA的關(guān)鍵酶是CG4792，并將其命名為Dicer。Dicer是RNaseⅢ家族中的成員，它含有解旋酶結(jié)構(gòu)域、PAZ結(jié)構(gòu)域、RNaseⅢ催化區(qū)域和dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在其他生物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了Dicer類似物。siRNA分子兩條單鏈的3'端是羥基且具有2個(gè)突出的非配對(duì)堿基，5'端的磷酸基團(tuán)會(huì)被一種特殊的激酶保護(hù)起來(lái)，這一結(jié)構(gòu)是siRNA進(jìn)入效應(yīng)階段所必須的。

1.2 效應(yīng)階段

起始階段產(chǎn)生的siRNA進(jìn)一步與多種蛋白成分結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC的組成包括Argonaute家族蛋白、內(nèi)切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA鏈搜索活性等，其第一個(gè)亞單位為siRNA［5]。緊接著，在RNA解旋酶的作用下，RISC中的siRNA解鏈和正義鏈被去除，反義鏈與靶mRNA分子互補(bǔ)結(jié)合并切割靶mRNA分子，從而阻斷基因的表達(dá)。

1.3 擴(kuò)增階段

以mRNA為模板，siRNA為引物，在RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-directed RNA polymerase，RdRp）作用下，通過(guò)類似PCR的擴(kuò)增作用再次形成dsRNA，dsRNA又被Dicer切割產(chǎn)生次級(jí)siRNA，次級(jí)siRNA又進(jìn)入下輪循環(huán)，這樣就產(chǎn)生了一種級(jí)聯(lián)放大的效應(yīng)［6]。因此，只需要極少的dsRNA，就可以產(chǎn)生強(qiáng)大的沉默效應(yīng)。Chen等［7]發(fā)現(xiàn)在植物中，22 nt的siRNA對(duì)次級(jí)siRNA的形成起著關(guān)鍵作用。

2 植物RNAi作用的特點(diǎn)

2.1 具有高度序列特異性

Brummelkamp等［8]利用RNAi沉默人的MCF-7基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，siRNA上一對(duì)堿基突變會(huì)抑制沉默效應(yīng)，植物RNAi也存在這種高度的序列特異性，RNAi這種特性使得dsRNA只能特異地降解與之序列同源的mRNA，而不能對(duì)其他基因產(chǎn)生影響，這樣就保證了對(duì)目的基因的精確沉默。

2.2 沉默基因的高效性

由于RNAi存在級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，RNAi途徑一旦被啟動(dòng)，就可以高效沉默基因的表達(dá)，因此每個(gè)細(xì)胞只需少量的dsRNA就可以使目標(biāo)基因沉默［9]。向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入針對(duì)多個(gè)基因的dsRNA，還可以一次性沉默多個(gè)基因。Kubo等［10]經(jīng)過(guò)研究后發(fā)現(xiàn)，與棕櫚酸結(jié)合的27 nt dsRNAs（C16-dsRNAs）具有很高的膜通透性，而且具有很高的基因沉默效率。

2.3 RNAi的可擴(kuò)散性和遺傳性

目前已有大量的資料證實(shí)，在植物RNAi過(guò)程中siRNA充當(dāng)沉默信號(hào)［11]。沉默信號(hào)可以在植物體內(nèi)傳遞，局部傳遞通過(guò)胞間連絲實(shí)現(xiàn)，長(zhǎng)距離傳遞通過(guò)韌皮部進(jìn)行；通過(guò)嫁接沉默信號(hào)可以在砧木和接穗之間雙向傳遞，而且沉默信號(hào)可以在不同的物種個(gè)體間傳遞。如植物與取食植物的昆蟲之間，沉默效應(yīng)甚至可以傳遞給后代［12]。

2.4 沉默信號(hào)的高穩(wěn)定性

siRNA的3'端有突出的TT或UU堿基，因此化學(xué)性質(zhì)很穩(wěn)定，無(wú)須像反義核苷酸那樣進(jìn)行廣泛的化學(xué)修飾以提高半衰期［1]。

3 RNAi在植物中的應(yīng)用

RNAi具有特異性、高效性、作用迅速和高穩(wěn)定性等特點(diǎn)，利用RNAi技術(shù)的這些特點(diǎn)可以進(jìn)行植物基因功能分析，并對(duì)某些基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，也可以對(duì)植物進(jìn)行改良。另外，RNAi在植物抗病蟲、抗逆性等方面也有重要的作用。總之，RNA干擾作為一種反向遺傳學(xué)的研究方法，為植物基因組學(xué)的發(fā)展提供了一個(gè)很好的技術(shù)平臺(tái)。

3.1 植物基因功能分析

人類已經(jīng)進(jìn)入后基因組時(shí)代，基因組學(xué)的重心已由結(jié)構(gòu)基因組學(xué)轉(zhuǎn)向功能基因組學(xué)，RNAi技術(shù)以其高度專一性和作用迅速等特點(diǎn)，為研究功能基因組學(xué)提供了一個(gè)高效、便捷的平臺(tái)。利用RNAi研究植物基因功能已取得了較大進(jìn)展，Gong等［13]在研究SOS2家族的蛋白激酶基因PKS時(shí)發(fā)現(xiàn)，將PKS18導(dǎo)入擬南芥中后，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)ABA敏感，當(dāng)用RNAi將PKS18沉默后，植株對(duì)ABA不敏感。由此證明，PKS18與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。Nishihara等［14]從煙草的花瓣上分離克隆了查耳酮異構(gòu)酶（CHI）基因，并利用RNA干擾對(duì)其進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因可影響煙草花瓣顏色和類黃酮的積累。Xu等［15]利用RNA干擾技術(shù)研究水稻OsPIN1發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因水稻中不定根的生長(zhǎng)和發(fā)育明顯受到抑制，因此研究者認(rèn)為0sPIN1基因在水稻不定根的發(fā)生和發(fā)育上有重要作用。PIN2是在茄科植物中發(fā)現(xiàn)的絲氨酸蛋白酶抑制劑，Sin等［16]利用RNA干擾技術(shù)使PIN2基因的表達(dá)受阻，結(jié)果種子的形成受到影響。通過(guò)細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)分析表明，該基因表達(dá)降低使得種子的內(nèi)表皮發(fā)育不正常，最終造成種子敗育。由此證明，PIN2基因與內(nèi)種皮的發(fā)育有關(guān)。通過(guò)對(duì)基因家族中高度保守的序列構(gòu)建RNAi載體，可以對(duì)整個(gè)基因家族進(jìn)行功能分析，已有科學(xué)家利用此方法對(duì)基因家族功能進(jìn)行分析。

3.2 植物改良方面的應(yīng)用

在植物改良方面，RNAi顯示了極大的優(yōu)勢(shì)，與傳統(tǒng)的育種方式相比，它不僅可以縮短育種周期，而且可以特定的改變農(nóng)產(chǎn)品的某種品質(zhì)，從而滿足人們的特定需求。番茄是類胡蘿卜素和黃酮類化合物的主要食物來(lái)源，Davuluri等［17]利用RNAi技術(shù)，特異地抑制了番茄內(nèi)源性光形態(tài)建成調(diào)節(jié)基因DET1的表達(dá)，相應(yīng)的類胡蘿卜素和黃酮類化合物的含量提高，這表明通過(guò)對(duì)調(diào)控基因進(jìn)行沉默，可以同時(shí)影響幾個(gè)擁有不同合成途徑的植物營(yíng)養(yǎng)素的產(chǎn)量，為改變農(nóng)作物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供了一個(gè)很好的方法。利用生物學(xué)方法降低煙草中的有害成分，一直是人們關(guān)注的問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)，N亞硝基去甲煙堿（NNN）能導(dǎo)致試驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生癌變，NNN是去甲煙堿亞硝化形成的，而去甲煙堿是尼古丁在脫甲基酶作用下形成的次級(jí)生物堿。因此，通過(guò)降低去甲煙堿的含量即可起到降低有害成分NNN的作用。Lewis等［18]利用RNAi技術(shù)沉默了煙草中的脫甲基酶基因發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草中的去甲煙堿的含量與對(duì)照相比降低了6倍，NNN的含量也明顯降低。青蒿素是從艾草中分離出來(lái)的一種抗瘧疾藥物，但它在艾草中的含量很低。Zhang等［19]研究了艾草中的一種鯊烯合酶SQS，該酶是固醇合成途徑的關(guān)鍵酶，而固醇合成通路影響青蒿素的合成，他們利用發(fā)夾RNA介導(dǎo)的RNAi技術(shù)沉默SQS的表達(dá)，在得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株中青蒿素含量顯著增加。這個(gè)結(jié)果表明，RNAi在改變植物代謝物含量方面有重要作用。

3.3 植物抗病毒研究中的應(yīng)用

在植物中，RNAi具有抵抗病毒入侵的作用，是植物抵抗病毒感染的防御機(jī)制之一。體外設(shè)計(jì)合成與病毒同源的dsRNA，然后將其導(dǎo)入植物體，當(dāng)用相同的病毒感染植物時(shí)，植物會(huì)通過(guò)RNAi機(jī)制對(duì)病毒轉(zhuǎn)錄的mRNA進(jìn)行切割降解，從而阻止病毒的復(fù)制擴(kuò)張，進(jìn)而保護(hù)植物體不受病毒危害。Andika等［20]利用RNAi使煙草獲得了抗甜菜壞死黃葉病毒的抗性，而且發(fā)現(xiàn)煙草葉片對(duì)病毒的抗性強(qiáng)于根部。Shimizu等［21]利用RNAi沉默了水稻矮縮病毒的一個(gè)病毒原質(zhì)基質(zhì)蛋白基因Pns12，結(jié)果轉(zhuǎn)基因水稻獲得了對(duì)該病毒抗性，他們認(rèn)為利用RNAi沉默病毒復(fù)制相關(guān)蛋白，可以高效的控制農(nóng)作物病毒感染。Zhang等［22]以苜?；ㄈ~病毒、豆莢斑點(diǎn)病毒和大豆花葉病毒的保守序列為模板，分別構(gòu)建了大約150 bp的短反向重復(fù)序列，將這3種結(jié)構(gòu)組裝進(jìn)表達(dá)載體后導(dǎo)入大豆植株，最后獲得3株轉(zhuǎn)基因植株，且其對(duì)3種病毒都具有抗性。Zhou等［23]利用RNAi研究水稻條紋病毒（RSV），構(gòu)建了針對(duì)RSV外殼蛋白和疾病特異性蛋白的兩種沉默表達(dá)載體，然后將它們導(dǎo)入水稻品種Suyunuo and Guanglingxiangjing，結(jié)果轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)RSV的抗性都增加。這些研究都證明，利用RNAi可以有效的抵抗病毒對(duì)植物的傷害。

3.4 植物抗蟲害方面的應(yīng)用

在植物抗蟲方面，利用RNAi也取得了很多研究進(jìn)展。Mao等［24]在棉花中表達(dá)了針對(duì)P450基因CYP6AE14的雙鏈RNA，棉鈴蟲食用了此種轉(zhuǎn)基因植物后，CYP6AE14基因的表達(dá)顯著降低，對(duì)棉酚的耐受性大大減弱，棉鈴蟲生長(zhǎng)變得緩慢。Sindhu等［25]向擬南芥中導(dǎo)入了4個(gè)甜菜孢囊線蟲生命周期相關(guān)基因的dsRNA，線蟲在取食RNAi植物后，其體內(nèi)4個(gè)基因的表達(dá)都受到抑制，并且轉(zhuǎn)基因植株中成熟雌性線蟲的數(shù)量明顯減少。Zha等［26]利用RNAi研究了褐飛虱的中腸基因，他們將3種中腸基因的dsRNA導(dǎo)入水稻植株，然后喂食褐飛虱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，褐飛虱中這3種基因的表達(dá)都受到抑制，但是褐飛虱并沒(méi)有出現(xiàn)致命性死亡。Ibrahim等［27]將酪氨酸磷酸酶（TP）和線粒體應(yīng)激70蛋白前體（MSP）的RNAi結(jié)構(gòu)導(dǎo)入大豆根部，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由根結(jié)線蟲引起的蟲癭減弱，同時(shí)根結(jié)線蟲與對(duì)照組相比個(gè)體也明顯變小。Matsunaga等［28]將南方根結(jié)線蟲POS-1基因的dsRNA接種到番茄的根部，接著用根結(jié)線蟲侵染根部發(fā)現(xiàn)，根結(jié)線蟲的孵化率與對(duì)照組相比明顯降低。以上研究表明，在植物中表達(dá)與昆蟲同源的雙鏈RNA，可以觸發(fā)取食昆蟲體內(nèi)發(fā)生RNA干擾，進(jìn)而影響昆蟲生長(zhǎng)甚至殺死昆蟲。而且利用RNAi技術(shù)防治害蟲具有很高的特異性，不會(huì)對(duì)其他有益昆蟲產(chǎn)生影響。

3.5 植物抗逆性中的應(yīng)用

RNA干擾技術(shù)應(yīng)用于植物抗逆性方面的研究比較少。Kaplan等［29]研究發(fā)現(xiàn)，將擬南芥在4℃冷凍下處理，植株中的β-淀粉酶（BMY8）被誘導(dǎo)，且植株中積累了大量麥芽糖，而BMY8-RNAi株系經(jīng)過(guò)4℃冷凍脅迫后，植株中麥芽糖的積累量很少，通過(guò)測(cè)定發(fā)現(xiàn)BMY8-RNAi株系的葉綠素?zé)晒饴蔉v/Fm與野生型相比降低了。該研究表明，在凍脅迫作用下增加植物體內(nèi)麥芽糖含量有助于保護(hù)電子傳遞鏈上的蛋白質(zhì) 。Marzin等［30]利用瞬時(shí)誘導(dǎo)基因沉默（TIGS）的方法，篩選大麥干旱脅迫應(yīng)答相關(guān)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下有4個(gè)基因的表達(dá)量下降，而對(duì)照組則沒(méi)有任何變化，4個(gè)表達(dá)量下降的基因分別編碼大麥干旱應(yīng)答因子HvDRF1、脫水蛋白6、胚胎發(fā)育后期豐富蛋白HVA1和液泡膜Na /H逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HvHNX1。Manavalan等［31]利用RNAi技術(shù)阻斷了水稻的鯊稀合酶基因，當(dāng)在暗箱里干旱處理一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株更晚表現(xiàn)出萎蔫癥狀，在其生殖期對(duì)其進(jìn)行干旱處理，轉(zhuǎn)基因植株失水情況較輕，該研究為水稻抗旱提供了策略。利用RNAi篩選與抗逆性相關(guān)的基因，從而改造植株使其具有抗旱、抗溫度脅迫等抗性，將有利于植株在逆境中生存。

4 展望

RNAi介導(dǎo)的基因沉默是植物在基因調(diào)控水平上的自我保護(hù)機(jī)制，是一種高效、特異性強(qiáng)的基因阻斷技術(shù)，在植物基因功能研究、作物品種改良、病蟲害防治等方面發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)RNAi發(fā)展迅速，為功能基因組學(xué)研究提供了有力工具，現(xiàn)已成為生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。雖然RNAi的研究已經(jīng)取得了很大的成果，但關(guān)于RNAi機(jī)制仍有很多問(wèn)題沒(méi)有解決，如需要多少分子的siRNA才能敲除一個(gè)基因，哪些蛋白成分參與了siRNA在生物體內(nèi)的擴(kuò)散，RISC是如何精確識(shí)別正反兩條鏈；靶標(biāo)mRNA的哪些性質(zhì)會(huì)影響RNAi的穩(wěn)定性等等。同時(shí)，RNAi的安全性也需進(jìn)一步驗(yàn)證。這些都阻礙了RNAi技術(shù)的發(fā)展，也影響了其在植物中的應(yīng)用。不過(guò)，隨著植物基因組序列的不斷開(kāi)發(fā)，以及人們對(duì)RNAi技術(shù)的不斷深入研究，該技術(shù)也將在植物各領(lǐng)域的研究中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

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