蔥蒜類蔬菜遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

高行英 李梅蘭 王婷婷 侯雷平

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，太谷 030801）

蔥蒜類蔬菜是百合科蔥屬中以嫩葉、假莖、鱗莖或花薹為食用器官的二年生草本植物。該類蔬菜在我國栽培歷史悠久，在不同的生態(tài)環(huán)境下通過人工選擇和自然淘汰，產(chǎn)生了豐富的形態(tài)變異和生態(tài)分化類型，包括洋蔥（A. cepa L.）、大蒜（A. sativum L.）、韭菜（A. tuberosum Rottl. ex Spr.）、大蔥（A. fistulosum L.）、細(xì)香蔥（A. schoenoprasum L.）、韭蔥（A. porrum L.）、胡蔥（A. ascalonicum L.）和薤（A. chinensis G. Don） 等［1］。

蔥蒜類蔬菜以其豐富的營養(yǎng)成分以及獨特的辛香風(fēng)味而成為調(diào)味佳品，同時又有藥用和保健價值。如韭菜中含豐富的維生素C、碳水化合物及硫、磷和鐵等礦物質(zhì)，尤其富含胡蘿卜素和纖維素，還含有辛香的揮發(fā)性物質(zhì)——硫化丙烯，有增進(jìn)食欲和殺菌的作用［2］；洋蔥含有蛋白質(zhì)、粗纖維及糖等多種營養(yǎng)成分，還含有18 種氨基酸及硒、鋅、銅及鎂等多種微量元素，除具有殺菌作用外，還具有抗心血管疾病、抗癌、降血壓及防治骨質(zhì)疏松等作用［3］；而大蒜對葡萄球菌、肺炎雙球菌及大腸桿菌等均具有殺滅作用，且具有降血壓、降血脂、抗衰老、抗血栓形成和防治糖尿病等功能。此外，還有抗氧化、抗癌、抗突變、抗氣喘和免疫調(diào)節(jié)等很多生物學(xué)活性［4］。近年來，研究還發(fā)現(xiàn)這類植物中含有一類含硫化合物——蒜素以及與之相關(guān)的一些含硫次生代謝物，在防治腫瘤方面也有獨特的作用，使其作用及其機(jī)理的研究倍受關(guān)注［5］。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日益成熟，許多植物已經(jīng)取得新品種，這也為蔥蒜類蔬菜的育種提供了一條新的途徑。目前，在蔥蒜類蔬菜的轉(zhuǎn)化研究方面已經(jīng)取得了一些成果。本文是通過對蔥蒜類蔬菜遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)行總結(jié)，以期為蔥蒜類的遺傳轉(zhuǎn)化提供參考。

1 轉(zhuǎn)化成功的蔬菜種類和性狀

有關(guān)蔥蒜類蔬菜遺傳轉(zhuǎn)化的研究從20世紀(jì)90年代就已開始一以來對于相關(guān)的各種因素進(jìn)行了優(yōu)化，最早研究成功的是洋蔥。Eady和Joubert等［6，7］對洋蔥轉(zhuǎn)化過程中的相關(guān)因素包括酚類物質(zhì)的作用進(jìn)行的研究和探討，成功進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，其將GUS基因?qū)胙笫[并進(jìn)行了表達(dá)［8］。之后Barandiaran等［9］將GUS基因?qū)氪笏庵校怂岱治龅慕Y(jié)果表明該基因已經(jīng)整合到大蒜的基因組中；Zheng等［10］將目的基因?qū)刖率[體內(nèi)后，組織的GUS染色效果明顯，轉(zhuǎn)基因植株移植到溫室后生長良好；張松等［11］采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對韭菜進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，通過PCR分析及Southern檢測，外源基因已經(jīng)整合到韭菜染色體上；譚偉等［12］對大蔥轉(zhuǎn)化中的各種因素進(jìn)行優(yōu)化，并成功獲得轉(zhuǎn)基因大蒜新品種。蔥蒜類蔬菜遺傳轉(zhuǎn)化陸續(xù)成功，目前已經(jīng)獲得成功的品種包括：大蒜、韭蔥、大蔥及韭菜等，其中研究最多且最成熟的為洋蔥和大蒜。

從轉(zhuǎn)化的性狀看，最早獲得的是抗除草劑基因的導(dǎo)入。Eady等［13］利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bar基因?qū)胙笫[幼胚得到抗除草劑植株，用草銨膦噴霧處理，轉(zhuǎn)基因植株仍能正常生長；Sun等［14］將Bar基因?qū)胙笫[表皮細(xì)胞得到抗除草劑洋蔥品種；Park等［15］以大蒜愈傷組織作為受體，利用基因槍轉(zhuǎn)化抗除草劑基因，獲得再生植株，當(dāng)除草劑濃度為3 mg/L時，植株仍能生存。另外，抗蟲基因的導(dǎo)入也相當(dāng)成熟。Zheng等［16］將cry1Ca基因轉(zhuǎn)入大蒜愈傷組織得到轉(zhuǎn)基因抗蟲植株，用轉(zhuǎn)基因大蒜葉片飼喂3 d的甜菜夜蛾幼蟲，結(jié)果表明轉(zhuǎn)cry1Ca基因的大蒜對甜菜夜蛾具有抗性；譚偉等［12］將蘇云金桿菌基因CryIA （b）轉(zhuǎn)入大蔥組織得到抗蟲大蔥。

另外，還進(jìn)行了抗逆性方面的轉(zhuǎn)化。徐啟江等［17］將鋅指蛋白OSISAPI基因?qū)胙笫[鱗莖盤胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化后，進(jìn)行NaCl和NaHCO3復(fù)合鹽進(jìn)行脅迫處理，當(dāng)總濃度為200 mmol/L時，處理7 d后未轉(zhuǎn)基因植株枯萎黃化、甚至死亡，而轉(zhuǎn)基因植株生長正常，且轉(zhuǎn)基因植株的最大耐受濃度為400 mmol/L；劉海燕等［18］將MpASR基因?qū)胙笫[表皮在非生物脅迫，如冷、干旱、鹽、水淹、重金屬和機(jī)械傷害等條件下誘導(dǎo)表達(dá)，從而獲得抗逆境能力很強(qiáng)的洋蔥植株。洋蔥中含有致淚成分環(huán)蒜氨酸，Kamata等［19］將催淚因子合成酶（LFS）基因?qū)胙笫[體內(nèi)，得到抑制環(huán)蒜氨酸合成的洋蔥品種。

2 遺傳轉(zhuǎn)化的方法

目前，已成功實現(xiàn)蔥蒜類遺傳轉(zhuǎn)化并獲得轉(zhuǎn)化植株的方法，即基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。1987年，Vlein首先報道了利用基因槍法將TMV（煙草花葉病毒）RNA吸附到鎢粒表面，轟擊洋蔥表皮細(xì)胞，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)病毒RNA能進(jìn)行復(fù)制，并以同樣技術(shù)將CAT基因?qū)胙笫[表皮細(xì)胞；Eady等［8］通過基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥胚根尖，培養(yǎng)1-2周的根尖GUS表達(dá)率達(dá)到20%左右，4-8周根尖的表達(dá)率達(dá)到30%；徐啟江等［17］轉(zhuǎn)化洋蔥胚性愈傷后的GUS基因瞬時表達(dá)率達(dá)到73.33%；Sun等［14］對洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化規(guī)模為90%，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞率為2.5%；Aswath等［20］成功應(yīng)用該法轉(zhuǎn)化了洋蔥愈傷組織，轉(zhuǎn)化率達(dá)到23%；Barandiaran等［9］應(yīng)用基因槍法介導(dǎo)轉(zhuǎn)化了不同大蒜外植體包括成熟種子、未成熟種子、嫩葉及愈傷組織，PCR結(jié)果表明所有的材料均能進(jìn)行轉(zhuǎn)化，而GUS瞬時表達(dá)率表明葉片的轉(zhuǎn)化效果最佳，幼嫩鱗莖次之，表達(dá)率均達(dá)到40%以上。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是目前應(yīng)用最廣泛，且結(jié)果較為理想、技術(shù)較為成熟的一種基因轉(zhuǎn)化方法。Eady等［8］以農(nóng)桿菌介導(dǎo)洋蔥轉(zhuǎn)化，GUS染色瞬時表達(dá)為15%左右；Aswath等［20］轉(zhuǎn)化了洋蔥愈傷組織，轉(zhuǎn)化率為27%；而Sun等［14］以農(nóng)桿菌介導(dǎo)洋蔥轉(zhuǎn)化后，轉(zhuǎn)化規(guī)模為30%，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞率為11%，說明兩種轉(zhuǎn)化方法分別有各自的優(yōu)點。另外，Kamata等［19］轉(zhuǎn)化洋蔥愈傷組織后GFP的熒光表達(dá)率達(dá)到50%；Kondo等［21］轉(zhuǎn)化大蒜莖尖分生組織后，Southern雜交檢測表明轉(zhuǎn)基因株系都是單拷貝；Eady等［22］采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化韭蔥和大蒜也得到兩個轉(zhuǎn)基因株系。

3 采用的外植體種類

蔥蒜類蔬菜可作為外植體的組織包括莖尖、鱗莖盤、雙鱗片、花蕾、子房、胚珠、花托和未成熟的胚等。目前，遺傳轉(zhuǎn)化中所用的受體材料多為愈傷組織，其來源眾多，最常用的是種子胚根。Zheng等［10］用大蒜幼胚和成熟種子作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化獲得了轉(zhuǎn)化植株；Aswath等［20］用洋蔥成熟胚，通過愈傷組織再生途徑成功獲得轉(zhuǎn)基因再生植株，且轉(zhuǎn)化率達(dá)到20%以上。另外，Zheng等［16］以試管苗根尖、珠芽誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化及再生也獲得了轉(zhuǎn)化體，胚根尖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到1.47%，試管苗根尖的轉(zhuǎn)化率為1.23%，而株芽的轉(zhuǎn)化率僅有0.32%；Buiteveld等［23］用韭蔥的胚性愈傷組織建立的胚性懸浮細(xì)胞系分離原生質(zhì)體，經(jīng)培養(yǎng)獲得了再生植株，從而為轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

在蔥蒜類蔬菜的轉(zhuǎn)化過程中，常采用幼胚、根尖、葉片和莖尖等組織直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化。Sun等［14］、劉海燕等［18］和劉肖等［24］以洋蔥表皮直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化獲得成功，而Eady等［25］多用洋蔥幼胚直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞進(jìn)入再生體系得到轉(zhuǎn)基因植株。Barandiaran等［9］用洋蔥幼嫩葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)化，GUS瞬時表達(dá)達(dá)到40%以上；Kenel等［26］對大蒜幼嫩葉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其GFP表達(dá)率達(dá)到55%，轉(zhuǎn)化效率為4.1%。另外，Eady等［8］還以預(yù)培養(yǎng)2 d的胚根進(jìn)行轉(zhuǎn)化，GUS表達(dá)率達(dá)到20%；張松等［11］用預(yù)培養(yǎng)6 d后的根尖轉(zhuǎn)化后再生率達(dá)到39%，出芽率達(dá)到4%。

4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的相關(guān)因素

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中，存在多種遺傳因子和外界因素影響。為了提高轉(zhuǎn)化效率，人們從植株基因型、菌株及菌液濃度、侵染條件和共培養(yǎng)條件等方面對農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行優(yōu)化，不同程度地提高了轉(zhuǎn)化效率［27］。

4.1 植株基因型

不同基因型對農(nóng)桿菌的敏感程度不同，Zheng等［16］研究表明3種大蒜品種Messidrome、Morasol發(fā)現(xiàn)Printanor轉(zhuǎn)化后，Printanor的轉(zhuǎn)化率為1.5%左右，而其他品種的轉(zhuǎn)化率僅在0.5%左右；Zheng等［10］研究Atlas、Bawang Bali和Kuning 3種大蔥品種及Sturon和Hyton洋蔥品種對轉(zhuǎn)化的影響發(fā)現(xiàn)，Bawang Bali的GUS瞬時表達(dá)達(dá)到70%，而Atlas為40%左右。另外，植物基因型還通過影響再生體系的建立而影響轉(zhuǎn)化，Bohanec等［28］取洋蔥子房誘導(dǎo)單倍體，4個品種中Daytona再生頻率為0，而Xph3371再生頻率為7.6%；張松等［29］同樣取韭菜14個品種根尖，其愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽誘導(dǎo)率也不同。Saika等［30］在不同水稻品種Nipponbare和Kasalath對轉(zhuǎn)化影響的結(jié)果表明，Kasalath的綠色熒光性和轉(zhuǎn)化效果更高，也說明了這一問題。

4.2 農(nóng)桿菌菌株和菌液濃度

農(nóng)桿菌菌株屬性對轉(zhuǎn)化的成功具有決定性影響。不同菌株對同一受體材料的侵染能力相差較大。許多報告表明，EHA101、LBA 4404、A281、C58和ASE1等菌株的轉(zhuǎn)化效果較好。蔥蒜類植株轉(zhuǎn)化中最常用的菌株為LBA4404。Zheng等［10］用兩種菌株EHA105和LBA4404進(jìn)行轉(zhuǎn)化，對香蔥而言LBA4404的效果好，而對洋蔥而言EHA105的效果更好；楊愛國等［31］在農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米轉(zhuǎn)化中的研究表明，EHA105菌株轉(zhuǎn)化后GUS表達(dá)率達(dá)到70%，再生率達(dá)到20%，而用LBA4404進(jìn)行轉(zhuǎn)化GUS表達(dá)率為40%，再生率為14%。

菌液濃度對不同的植物外植體轉(zhuǎn)化存在差異。濃度過低時，農(nóng)桿菌數(shù)量過少，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率較低；隨著濃度的升高，轉(zhuǎn)化率有所上升；但濃度過高時，農(nóng)桿菌將外植體全面包圍，不利于洗菌，導(dǎo)致部分外植體死亡，使轉(zhuǎn)化率下降。在蔥蒜類蔬菜的遺傳轉(zhuǎn)化中大多采用的菌液OD600為0.6左右，劉海燕等［18］研究表明，OD600為0.6時，洋蔥表皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率均值最大。當(dāng)OD600為0.2時，轉(zhuǎn)化效果不明顯，轉(zhuǎn)化率隨農(nóng)桿菌濃度的增加而增加；而當(dāng)OD600大于0.6時，洋蔥表皮細(xì)胞呈空泡化，死亡細(xì)胞越來越多。Kamata等［19］則認(rèn)為洋蔥懸浮培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)化所用濃度OD600為0.1-0.2。Kondo等［21］在大蔥轉(zhuǎn)化中，農(nóng)桿菌的OD600值也為0.6；Eady等［22］在韭菜和大蒜轉(zhuǎn)化時，OD500下的菌液濃度為0.5-1.0時效果最佳，本研究結(jié)果也表明，韭菜轉(zhuǎn)化中最佳的菌液濃度OD600為0.6。

4.3 侵染方式和時間

單子葉植物細(xì)胞缺乏農(nóng)桿菌附著位點，農(nóng)桿菌侵染方式一般是應(yīng)用創(chuàng)傷細(xì)胞：菌液浸泡侵染；抽氣減壓和超聲波輔助的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法（SAAT ）等促進(jìn)農(nóng)桿菌的吸附，提高轉(zhuǎn)化效率。Eady等［25］認(rèn)為先將洋蔥幼胚與菌液渦旋混合30 s，然后將組織放置在真空環(huán)境中滲透30 min，菌液侵入組織的效果最佳，而且此方法被很多研究人員采納，用于韭菜和大蒜等植株的轉(zhuǎn)化。張松等［11］用直接浸泡法侵染表明，當(dāng)菌液OD600為0.6時，侵染5 min，韭菜轉(zhuǎn)化率達(dá)到5. 6 %。

菌液侵染時間對轉(zhuǎn)化也是相當(dāng)重要的，侵染時間短時，菌體與受體細(xì)胞接觸時間短，吸附于外植體的菌體少，轉(zhuǎn)化率低；隨著侵染時間的延長，轉(zhuǎn)化率得到提升，但侵染時間過長，菌體數(shù)目過大會導(dǎo)致受體細(xì)胞受到嚴(yán)重的損傷，且不能徹底除菌。蔥蒜類蔬菜的侵染時間不等，常用的侵染時間為5-10 min。Aswath等［20］轉(zhuǎn)化洋蔥時的侵染濃度為5 min；Zheng等［10］侵染大蒜的時間為10 min；劉肖飛等［24］則認(rèn)為將洋蔥表皮侵染20 min的轉(zhuǎn)化效率最高；徐春波等［32］在紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化中，菌液OD600為0.6，侵染10 min時，GUS陽性發(fā)生率最高，與本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)韭菜轉(zhuǎn)化的試驗結(jié)果一致。

4.4 共培養(yǎng)條件

共培養(yǎng)在整個轉(zhuǎn)化過程中完成農(nóng)桿菌的附著、T-DNA的轉(zhuǎn)移整合，農(nóng)桿菌附著外植體表面后并不能立刻轉(zhuǎn)化，只有在創(chuàng)傷部位生存一定時間后菌株才能誘導(dǎo)腫瘤。譚偉等［12］在大蔥的研究中表明，GUS 基因瞬間表達(dá)率均值從大到小依次是共培養(yǎng)時間3 d> 2 d> 4 d> 1 d> 5 d；共培養(yǎng)時間<3 d時，隨共培養(yǎng)時間的延長，GUS 基因瞬間表達(dá)率增加；>3 d時，則相反。Eady等［13］認(rèn)為菌液用真空滲透法處理30 min，再進(jìn)行共培養(yǎng)6 d后的轉(zhuǎn)化效率最高。共培養(yǎng)溫度在轉(zhuǎn)化中充當(dāng)著重要的角色。雖然，外植體共培養(yǎng)試驗通常采用25℃，但是認(rèn)為較低的溫度（19-22℃）是更佳。Kondo等［21］在大蔥的研究中，當(dāng)溫度為22℃時GUS瞬時表達(dá)率最高，為64%，溫度為20℃時GUS表達(dá)率54.2%，而溫度為24℃時反而下降到44.2%。我們在韭菜轉(zhuǎn)化中研究結(jié)果表明，共培養(yǎng)3 d為最佳時間。

4.5 Vir 基因的活化

1985年，Stachel等［33］首次從煙草葉片的傷口中分離出乙酰丁香酮（AS）和羥基乙酰丁香酮（HOAS），并證明這些酚類物質(zhì)能激活Ti 質(zhì)粒上Vir 區(qū)基因的表達(dá)。Joubert等［7］研究了酚類物質(zhì)對洋蔥轉(zhuǎn)化遺傳的影響發(fā)現(xiàn)，當(dāng)AS濃度為100 μmol/L時，細(xì)菌的生長和Vir毒性的活化能力最高；對洋蔥幼胚進(jìn)行轉(zhuǎn)化，AS濃度為250 μmol/L，組織的GUS表達(dá)率為60%，濃度過高時表達(dá)率反而下降。另外，在100 μmol/L濃度下，多種酚類化合物的作用中，AS的作用最佳；其次為芐叉丙酮。Eady等［25］在菌液培養(yǎng)過程中加入200 μmol/L AS誘導(dǎo)活化農(nóng)桿菌4 h后用于轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到2.7%。張佳星等［34］闡述了單子葉植物不是農(nóng)桿菌的天然宿主，需添加外源信號物質(zhì)如AS來促進(jìn)侵染效果，AS是農(nóng)桿菌與植物共培養(yǎng)時必不可少的。

5 展望

運用基因工程培育轉(zhuǎn)基因蔥蒜類新品種為育種開辟了新的途徑，具有廣闊的應(yīng)用前景，但在實際工作中存在許多問題和挑戰(zhàn)。首先，可用于蔥蒜類轉(zhuǎn)化的基因較少，遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)需要克服植株再生、基因型的依賴性，以及組織培養(yǎng)中的遺傳變異等問題；其次，外源基因在轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)的表達(dá)效果不甚理想，基因沉默是轉(zhuǎn)基因過程普遍存在的問題；再次，轉(zhuǎn)基因安全性問題尚未完全明了和控制。因此，需要挖掘更多的基因資源用于蔥蒜類遺傳轉(zhuǎn)化，不斷完善已有的轉(zhuǎn)化方法，發(fā)展新的轉(zhuǎn)化體系和方法，建立起一個轉(zhuǎn)化效率高、重復(fù)性好、簡易、快速及適應(yīng)性廣的高效轉(zhuǎn)化體系，從而使目的基因由隨機(jī)整合到定向定位整合，多個目的基因?qū)胪皇荏w并在轉(zhuǎn)化植株中完整地表達(dá)。同時，對標(biāo)記基因進(jìn)行去除或改造，或培育無抗生素標(biāo)記基因（PMI）的轉(zhuǎn)基因植物，建立健全轉(zhuǎn)基因安全評價機(jī)制。蔥蒜類轉(zhuǎn)基因技術(shù)現(xiàn)今尚未完善，優(yōu)良農(nóng)藝性狀基因的轉(zhuǎn)化較少。因此，對蔥蒜類蔬菜進(jìn)行進(jìn)一步遺傳轉(zhuǎn)化研究非常必要，以得到更加優(yōu)質(zhì)的品種。

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