β-激動(dòng)劑類獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

■萬宇平 凌莉 高東微馮才偉 趙 濤 劉中勇

（1.北京望爾生物技術(shù)有限公司，北京 102206；2.廣東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東廣州 510623；3.番禺出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東廣州 511400；4.湛江出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東湛江 524022）

1 β-激動(dòng)劑類獸藥殘留危害及限量標(biāo)準(zhǔn)

β-激動(dòng)劑是一類由兒茶酚胺衍生合成的化合物，其中以鹽酸克倫特羅和沙丁胺醇較為常見。

克倫特羅(Clenbuterol,CL)又名雙氯醇胺、氨哮素、克喘素，是一種人工合成的β-腎上腺素受體激動(dòng)劑，具有強(qiáng)效松弛支氣管平滑肌作用[1]?？藖鎏亓_為瘦肉精的主要成分，其可增加蛋白質(zhì)的合成作用，使動(dòng)物瘦肉率增加，以致被某些不法養(yǎng)殖戶濫用，并造成在動(dòng)物組織中廣泛殘留。當(dāng)克倫特羅在動(dòng)物可食性組織中殘留蓄積，從而使食用這些動(dòng)物組織的人產(chǎn)生中毒反應(yīng)，危害人的身體健康，甚至危及生命安全，我國(guó)已經(jīng)禁止用克倫特羅做動(dòng)物飼料添加劑[2]。

沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)能與β-腎上腺素能受體結(jié)合,臨床上主要用于治療哮喘、支氣管痙攣等[3]。將沙丁胺醇作為飼料添加劑使用,能顯著促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、增加飼料轉(zhuǎn)化率和瘦肉率，但在某些養(yǎng)殖過程中該藥物被長(zhǎng)期、超量使用，則會(huì)在動(dòng)物組織中殘留蓄積，人們食用了這種動(dòng)物產(chǎn)品后會(huì)引發(fā)中毒，危及身體健康及生命安全。

β-激動(dòng)劑中最常作為促生長(zhǎng)劑使用的是克倫特羅(Clenbuterol，CL)，但隨著對(duì)克倫特羅檢測(cè)力度的加大，非法使用者開始轉(zhuǎn)向其他替代品。由于沙丁胺醇與克倫特羅的促生長(zhǎng)作用相差不大，其在動(dòng)物體內(nèi)的消除時(shí)間比克倫特羅短,毒性較弱,因此,沙丁胺醇就成為繼克倫特羅之后最主要的替代品，仍然對(duì)人們食用動(dòng)物組織安全性存在極大威脅。

我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)文件規(guī)定：克倫特羅、沙丁胺醇及其鹽、酯在所有食品動(dòng)物及所有可食組織中禁止使用，并且不得檢出。歐盟獸藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定：鹽酸克倫特羅含量在牛肝臟0.5 μg/kg、牛肌肉0.1 μg/kg、牛奶0.05 μg/kg、牛腎臟0.5 μg/kg、馬肝臟0.5 μg/kg、馬肌肉0.1 μg/kg、馬腎臟0.5 μg/kg。

2 β-激動(dòng)劑類獸藥殘留檢測(cè)方法研究進(jìn)展

目前檢測(cè)β-激動(dòng)劑類獸藥殘留的方法主要有兩大類別：一種能夠同時(shí)進(jìn)行分離、分析，具有高效分離技術(shù)和高檢測(cè)靈敏度，對(duì)殘留情況進(jìn)行定性、定量分析，主要包括液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、薄層色譜法（TLC）、氣象色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）和液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）聯(lián)用法等；另外一種是對(duì)沙丁胺醇、克倫特羅進(jìn)行定性、半定量的生物學(xué)方法，該方法具有選擇性高、檢測(cè)限低的特點(diǎn)，主要有酶聯(lián)免疫分析法、微生物方法和放射性免疫法等。

2.1 高效液相色譜法（HPLC）

尚紅霞等提出用固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定飼料中微量克倫特羅和沙丁胺醇的方法。選用Dikma Diamonsil C18-ODS分析柱(200 mm×4.6 mm,5 μm),乙腈-0.01 mol/l KH2PO4(pH值3.0)作流動(dòng)相,應(yīng)用波長(zhǎng)編程進(jìn)行檢測(cè)?？藗愄亓_和沙丁胺醇的線性范圍為0.1～100 μg/ml，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 99和0.999 77，檢出限分別為0.31 ng/ml和0.24 ng/ml,回收率分別為91.2%～92.0%和91.9%～93.0%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別是1.20%～2.05%和1.29%～2.51%[4]。

金雁等建立高效液相色譜法(HPLC)同時(shí)測(cè)定豬肉樣品中克倫特羅、沙丁胺醇、土霉素、四環(huán)素殘留量的檢測(cè)方法。樣品用0.01 mol/l EDTA-22Na、0.3%磷酸溶液、高氯酸(1∶1)的混合溶液提取，上清液過C18固相萃取柱凈化，采用高效液相色譜分離，二極管陣列檢測(cè)器(DAD)檢測(cè)，外標(biāo)法定量[5]。

出入境檢驗(yàn)檢疫的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1924—2007進(jìn)出口動(dòng)物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林殘留量的檢測(cè)方法，采用的是液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法：肉和肝的測(cè)定最低限為0.000 5 mg/kg。添加0.5、1.0、2.0 μg/kg中回收率為73.4%～96.4%，98.5%～126.5%，86.5%～102.0%。

2.2 氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）

張雪曼等建立了尿液中克倫特羅和沙丁胺醇同時(shí)測(cè)定的GC-MS方法。尿液在堿性條件下以異丁醇提取后，用Waters Oasis MCX小柱凈化，吹干后用BSTFA進(jìn)行硅烷化衍生，采用GC-EI-MS法，選擇離子方式采集數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，克倫特羅和沙丁胺醇的線性范圍為0.002～1.00 mg/l，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 3和0.998 5，方法檢出限可達(dá)0.5 μg/l(S/N=10)。尿液中克倫特羅和沙丁胺醇的回收率分別為75.9%～89.2%和73.6%～89.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均不大于 10%[6]。

農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1030—2006飼料中沙丁胺醇的測(cè)定：采用氣相色譜/質(zhì)譜法，適用于配合飼料、濃縮飼料及添加劑預(yù)混飼料中沙丁胺醇的測(cè)定，最低檢測(cè)濃度為0.02 mg/kg。

浙江省地方標(biāo)準(zhǔn)DB33/T 624—2006動(dòng)物組織中特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺殘留量的測(cè)定：同樣采用氣相色譜-質(zhì)譜法，適用于畜禽肌肉、肝臟、肺、腎等組織中特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等4種β-興奮劑殘留量的測(cè)定。方法檢測(cè)限為：特布他林1.0 μg/kg、克倫特羅2.0 μg/kg、沙丁胺醇1.0 μg/kg、萊克多巴胺2.0 μg/kg。

2.3 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）

我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22147—2008飼料中沙丁胺醇、萊克多巴胺和鹽酸克倫特羅的測(cè)定，同樣采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法，適用于配合飼料、濃縮飼料和添加劑預(yù)混合飼料中沙丁胺醇、萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅的測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)中沙丁胺醇、萊克多巴胺和鹽酸克倫特羅的檢測(cè)限均為0.01 mg/kg，定量限均為0.05 mg/kg。

SN/T 1924—2007進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林殘留量的檢測(cè)采用液相色譜-質(zhì)譜法。

2.4 毛細(xì)管電泳技術(shù)

陳紅青等建立了高效毛細(xì)管電泳同時(shí)測(cè)定飼料中鹽酸克倫特羅與沙丁胺醇的方法。通過對(duì)不同條件的考察，建立了電泳分析和樣品前處理的最佳條件。方法對(duì)鹽酸克倫特羅的添加回收率為83.2%～94.5%，最低檢測(cè)限為0.02 μg/ml；對(duì)沙丁胺醇的添加回收率為82.5%～93.7%，最低檢測(cè)限為 0.03 μg/ml[7]。

蔡春等建立了高效毛細(xì)管區(qū)帶電泳技術(shù)同時(shí)快速測(cè)定飼料中的鹽酸克倫特羅與沙丁胺醇的方法。對(duì)鹽酸克倫特羅的添加回收率為78%～92%，最低檢測(cè)限為0.5 mg/kg；對(duì)沙丁胺醇的添加回收率為74%～87%，最低檢出限為0.5 mg/kg[8]。

鄧光輝等建立了毛細(xì)管電泳電化學(xué)法對(duì)鹽酸克倫特羅、特布他林和沙丁胺醇進(jìn)行分離檢測(cè)。方法采用膠束電泳體系,以鉑圓盤為工作電極，考察了檢測(cè)電位、緩沖液濃度和pH值、十二烷基硫酸鈉(SDS)濃度、分離電壓等因素的影響。3個(gè)分離物在10 kV的分離電壓、緩沖體系為15 mmol/l(pH值9.0)硼砂+20 mmol/l SDS條件下得到分離。鹽酸克倫特羅、特布他林和沙丁胺醇的線性范圍分別為2.0～400、3.5～700、5.0～1 000 μg/l。方法已用于豬肉樣品的檢測(cè)[9]。

2.5 免疫分析技術(shù)（IA）

王俊平建立了沙丁胺醇直接酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)的方法，從硫酸沙丁胺醇出發(fā)制備了半抗原沙丁胺醇丁二酸衍生物，用混合酸酐法將半抗原與載體蛋白-鑰孔嘁血藍(lán)蛋白（KLH）偶聯(lián)作為免疫抗原制備了沙丁胺醇的多克隆抗體，建立了沙丁胺醇直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，該方法抗體最佳包被抗體量為 1 μg/孔，酶標(biāo)抗原稀釋比例為1∶16 000，掩蔽劑采用脫脂奶粉。所建立的方法IC50為 0.90 ng/ml，IC15達(dá)到了 0.05 ng/ml[10]。

張亞峰等研制了一種簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)的沙丁胺醇免疫膠體金檢測(cè)試紙條，對(duì)沙丁胺醇的檢測(cè)限為2.0 ng/ml，對(duì)其他β-興奮劑無交叉反應(yīng)性[11]。

汪慧榮對(duì)β-興奮劑克倫特羅、沙丁胺醇進(jìn)行了免疫檢測(cè)方法的研究，以純化的抗SAL多抗為基礎(chǔ)，酶標(biāo)板為載體建立SAL的IC-EIA方法，檢測(cè)線性 范 圍 為 0.5～10.0 ng/ml，IC50為 5.29 ng/ml，抗SAL多抗和CBL有較明顯的交叉反應(yīng)，達(dá)39.6%，表明該抗SAL多抗可同時(shí)用于SAL和CBL的檢測(cè)，檢測(cè)CBL的線性范圍為 0.5～50 ng/ml，IC50為13.37 ng/ml。以購(gòu)買的抗SAL單抗為基礎(chǔ)，磁性微粒為載體建立SAL的“一步法”IC-EIA，檢測(cè)時(shí)間2 h，線性范圍0.5～100 ng/ml，IC50為11.19 ng/ml，CBL和抗SAL單抗存在極明顯的交叉反應(yīng)，達(dá)107%，Terbutaline和抗SAL單抗也有弱的交叉反應(yīng)，為2%，其他β-興奮劑則和抗SAL單抗無交叉反應(yīng)，不同豬樣品的平均添加回收率為84.3%～118.6%[12]。

2.6 生物傳感分析法

侯長(zhǎng)軍等開發(fā)了一種鑒別β受體激動(dòng)劑的新型陣列傳感器。該傳感器由8種傳感物質(zhì)構(gòu)成，使用96孔板酶標(biāo)儀采集響應(yīng)數(shù)據(jù),結(jié)合主成分分析(PCA)、分層聚類分析(HCA)、判別分析(LDA)等模式識(shí)別方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,對(duì)5類β受體激動(dòng)劑及其混合物進(jìn)行檢測(cè)。PCA結(jié)果表明，該傳感器主要是基于空間結(jié)構(gòu)以及氫鍵作用實(shí)現(xiàn)對(duì)β受體激動(dòng)劑的識(shí)別；HCA結(jié)果顯示，93個(gè)分析樣本歸類正確；LDA結(jié)果顯示，該傳感器對(duì)于β受體激動(dòng)劑識(shí)別的準(zhǔn)確率達(dá)98.9%[13]。

王正武等研究了用于快速檢測(cè)沙丁胺醇的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，通過用碳納米管-聚硫堇-納米金依次修飾玻碳電極，再通過自組裝方法得到電化學(xué)免疫傳感器。能夠制備得到靈敏度高，穩(wěn)定性好，現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)沙丁胺醇的電化學(xué)免疫傳感器[14]。

3 結(jié)語

β-激動(dòng)劑類獸藥殘留檢測(cè)分析技術(shù)中，高效液相色譜法（HPLC）和酶聯(lián)免疫測(cè)定（ELISA）方法是目前應(yīng)用較為廣泛并且相互補(bǔ)充的兩種方法。HPLC，尤其是HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)，具有很高的檢測(cè)靈敏度、高分離效率和高準(zhǔn)確度，但實(shí)際檢測(cè)工作中需要配備相應(yīng)的大型檢測(cè)儀器支持，且檢測(cè)成本較高，主要適用于畜禽產(chǎn)品（如畜禽組織、牛奶、尿樣、肝臟等樣本）、飼料樣本中克倫特羅、沙丁胺醇藥物殘留的精確定量檢測(cè)。而ELISA檢測(cè)方法具有快速、靈敏、方便、檢測(cè)成本較低等特點(diǎn)，但檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度相對(duì)儀器檢測(cè)方法較不精確，側(cè)重在臨時(shí)大規(guī)模排查、檢測(cè)單位常規(guī)抽檢等工作中對(duì)紅霉素藥物的定性及半定量檢測(cè)。建立以酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）為輔的“篩選法”和液相色譜（HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）等儀器為“確證法”的多方法相結(jié)合的殘留檢測(cè)體系，進(jìn)行克倫特羅、沙丁胺醇藥物殘留檢測(cè)，對(duì)于保障食品安全和人民群眾健康尤為重要。