液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中尼卡巴嗪的含量

■金曉峰 章厲劼

(貴州省飼料監(jiān)察所，貴州貴陽(yáng) 550003)

尼卡巴嗪(Nicarbazin),別名球蟲凈，是一種廣譜抗球蟲藥物，常用于飼料藥物添加劑，具有較強(qiáng)的球蟲病防治作用[1-2]，禽類對(duì)尼卡巴嗪的抗藥性產(chǎn)生相當(dāng)緩慢，是目前較少受到球蟲抗藥性困擾的幾種藥物之一[3-4]。同時(shí)，它還具有良好的促進(jìn)禽類生長(zhǎng)發(fā)育的作用，因此，被廣泛應(yīng)用于禽類的飼養(yǎng)[5]。但是，尼卡巴嗪在禽肉及禽蛋中的殘留，是食品安全的一項(xiàng)嚴(yán)重隱患，目前尼卡巴嗪藥物殘留已被列為我國(guó)禽肉出口檢驗(yàn)的重要內(nèi)容之一。國(guó)家農(nóng)業(yè)部也明確指示，要進(jìn)一步完善飼料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，重點(diǎn)是飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法。并明確規(guī)定了飼料中尼卡巴嗪的最大允許添加量[6]。

尼卡巴嗪(Nicarbazin)為兩種單一成分4，4’-二硝基碳酰替苯胺(DNC)和α-羥基-4，6-二基嘧啶(HDP)組成的1∶1復(fù)合物。為黃色或黃綠色粉末，無(wú)臭，稍具異味。在乙腈、二甲基甲酰胺中微溶，在水、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、乙醚中不溶。而國(guó)外有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，主要起驅(qū)蟲作用的是DNC，而HDP只是輔助作用，但是當(dāng)二者1∶1組合時(shí)，驅(qū)蟲效果最好[7]。因此，本方法以DNC為標(biāo)示物對(duì)尼卡巴嗪的含量進(jìn)行測(cè)定(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1)。

圖1 DNC化學(xué)結(jié)構(gòu)式

目前，已報(bào)道的飼料中尼卡巴嗪的檢測(cè)方法主要有分光光度檢測(cè)方法[8]、高效液相色譜法[1-2，5-6]。我國(guó)也于2003年頒布了《GB/T 19423—2003飼料中尼卡巴嗪的測(cè)定高效液相色譜法》的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。但是目前國(guó)內(nèi)還沒有使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行確證檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法報(bào)道。因此，本文旨在建立一種操作簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果穩(wěn)定、可靠的LC-MS/MS方法，以保障對(duì)飼料中尼卡巴嗪殘留的確證檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 試劑

DNC對(duì)照品：德國(guó)WITEGA，含量98.5%；

DNC-D8對(duì)照品：德國(guó)WITEGA，含量98.0%；

NN-二甲基甲酰胺：色譜純；

乙腈：色譜純；

甲醇：色譜純；

甲酸：色譜純；

無(wú)水硫酸鈉：分析純；

正己烷：分析純；

試驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器設(shè)備

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó)Waters UPLC PremierXE；

高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)SIGMA 3K15；

電子分析天平：瑞士METTIJER AB104-S；

氮吹儀：美國(guó)Reacti-Therm III；

振蕩器：德國(guó)GLF 3005；

超聲波清洗機(jī)：上海冠特SG5200HPT。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1 分別精密稱取DNC及DNC-D8對(duì)照品適量，用NN-二甲基甲酰胺分別配制得到含DNC濃度為1 mg/ml的儲(chǔ)備液及含DNC-D8濃度為1 μg/ml的內(nèi)標(biāo)物儲(chǔ)備液。

1.3.2 將DNC-D8內(nèi)標(biāo)物儲(chǔ)備液稀釋為20 μg/l的內(nèi)標(biāo)物工作液。

1.3.3 分別精密量取適量的DNC儲(chǔ)備液，制得濃度為10、20、50、100、200、500、1 000 μg/l（含內(nèi)標(biāo)為100 μg/l）的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

2 DNC的分析過(guò)程

2.1 飼料中DNC的提取

準(zhǔn)確稱取2 g左右經(jīng)粉碎的飼料于50 ml離心管中，加入 20 μg/l的內(nèi)標(biāo)物工作液 200 μl，加入2.0 g無(wú)水硫酸鈉、10.0 ml乙腈，振蕩器上振蕩10 min，超聲提取10 min。10 000 r/min離心10 min，收集上清液。

2.2 提取液的凈化

將上述溶液在40℃下氮?dú)饬鞔蹈?，加?5%甲醇水溶液飽和的正己烷1.0 ml，渦旋1 min，再加入75%甲醇水溶液1.0 ml，渦旋1 min，40℃下靜置分層，棄去上層溶液，用75%甲醇水溶液飽和的正己烷1.0 ml再洗滌1次，40℃下靜置分層，取下層清液過(guò)0.22 μm濾膜后供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

3 測(cè)定方法

3.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC Shield RP18；

流動(dòng)相：甲醇+0.2%甲酸水溶液（75+25）；

流速：0.2 ml/min；

柱溫：30℃；

進(jìn)樣量：5 μl。

3.2 質(zhì)譜條件

離子源：ES-；

源溫：110℃；

霧化溫度：380℃；

霧化氣流：600 L/h；

錐孔氣流：50 L/h。

3.3 DNC、DNC-D8特征離子（見表1）

表1 DNC、DNC-D8特征離子

4 試驗(yàn)結(jié)果

4.1 試驗(yàn)圖譜

經(jīng)上述方法測(cè)試，標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白試樣及陽(yáng)性添加試樣經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀分析得到以下圖譜2～4。

4.2 線性關(guān)系

對(duì)照品工作液按峰面積以內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行回歸計(jì)算，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖5），在線性范圍為10～1 000 μg/l下相關(guān)系數(shù)R2為0.999 6。

4.3 試驗(yàn)精密度

將空白飼料添加成含DNC分別為10、50、100、500 μg/kg的陽(yáng)性添加試料，各6個(gè)平行樣，結(jié)果見表2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子圖譜

圖3 空白試樣特征離子圖譜

圖4 陽(yáng)性添加試樣特征離子圖譜

圖5 DNC標(biāo)準(zhǔn)曲線

5 小結(jié)

本文采用乙腈提取飼料中的DNC，正己烷液液萃取去除飼料中雜質(zhì)，通過(guò)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定DNC的含量。經(jīng)試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證，該方法操作簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果穩(wěn)定、可靠，可滿足飼料中尼卡巴嗪的含量檢測(cè)。

表2 飼料中DNC含量測(cè)定精密度試驗(yàn)結(jié)果

（參考文獻(xiàn)若干篇，刊略，需者可函索）