人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)小型豬急性心肌梗死模型心肌細(xì)胞再生的影響

張 嵬，楊 力，張亞東，李 婷，陳 越，劉曉程

(天津醫(yī)科大學(xué)心血管病臨床學(xué)院泰達(dá)國際心血管病醫(yī)院，天津 300457)

冠狀動(dòng)脈介入與搭橋術(shù)是目前心肌血運(yùn)重建的主流方法。對(duì)于心肌梗死患者，二者能明顯改善心肌血供，但無法恢復(fù)具有有效收縮功能的心肌細(xì)胞數(shù)量，亦無法改善心室重構(gòu)和心力衰竭。近10年來，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植用于心肌梗死治療的研究取得了較大進(jìn)展，但也發(fā)現(xiàn)了這一方法的弊端。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有自我更新、增殖及多向分化潛能的干細(xì)胞，其取材方便、來源廣泛、數(shù)量充足、免疫原性低、可避免倫理爭議，且增殖速度快、分化能力強(qiáng)，應(yīng)用前景廣泛［1］。研究發(fā)現(xiàn)，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在體外藥物干預(yù)后可向心肌細(xì)胞分化［2，3］，且在心肌梗死的小動(dòng)物模型中具有促進(jìn)心血管組織再生和修復(fù)的作用［4，5］。2012 年 3 ～12月，我們觀察了人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)小型豬急性心肌梗死模型心肌細(xì)胞再生的影響，旨在為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 CM-Dil(美國 Invitrogen公司);c-TnT鼠抗人單克隆抗體，c-kit鼠抗人單克隆抗體與兔抗人單克隆抗體(美國Lab Vision＆NEOMARKERS公司);vWF兔抗人多克隆抗體(英國Abcam公司);Masson三色法染色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)有限公司);TUNEL試劑盒(德國Roche公司);廣西巴馬小型豬(上海甲干生物科技有限公司);經(jīng)圖像分析軟件 Image Pro Plus 6.0(美國 Media Cybernetics公司);麻醉機(jī)(Detax-Ohmeda 700，美國);心電監(jiān)護(hù)儀(Detax-Ohmeda 700，美國);激光掃描共聚焦熒光顯微鏡(日本Nikon公司)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制備 無菌條件下采集臍帶標(biāo)本并剪成1 mm3左右大小的組織塊，應(yīng)用組織塊爬片法分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞并成功傳代擴(kuò)增至第5代達(dá)108數(shù)量級(jí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型，實(shí)驗(yàn)前采用CM-Dil標(biāo)記。

1.2.2 急性心肌梗死模型制作及干預(yù) 23只廣西巴馬小型豬(體質(zhì)量20～25 kg)經(jīng)肌注鹽酸賽拉嗪3 mg/kg與靜注丙泊酚20 mg誘導(dǎo)麻醉。氣管插管，呼吸機(jī)輔助通氣，潮氣量350 mL，15次/min，氧流量1 L/min。術(shù)中1% ～2%異氟烷吸入、丙泊酚2 mg/(kg·h)靜脈持續(xù)泵入維持麻醉，持續(xù)心電監(jiān)護(hù)。胸骨正中切口暴露心臟，缺血預(yù)適應(yīng)3次后(5 min/次)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支中、遠(yuǎn)端1/3交界處。7只結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后出現(xiàn)室顫，予電除顫后2只存活，5只死亡。心電圖及核素心肌灌注顯像確定18只心肌梗死模型制作成功。將18只造模豬隨機(jī)分為對(duì)照組、PBS組和移植組，每組6只。移植組釆用微量注射器將備好的標(biāo)記CM-Dil的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液(2 mL，1×107細(xì)胞/mL)經(jīng)心外膜呈矩陣分布多點(diǎn)注入梗死組織(每點(diǎn)注入0.2 mL)。PBS組以同樣方法注入等量PBS。對(duì)照組只造模不干預(yù)。術(shù)后3組均肌注青霉素160萬U，2次/d，連續(xù)3 d。

1.2.3 觀察項(xiàng)目

1.2.3.1 心肌灌注情況 模型建立后即刻和干預(yù)后6周行梗死區(qū)心肌灌注核素顯像:耳緣靜脈注射14.8 MBq/kg 99m锝—甲氧基異丁基異腈，給藥30 min后行心電門控心肌灌注核素顯像。儀器為GE Millennium VG-5，配低能通用型準(zhǔn)直器，2個(gè)探頭呈90°夾角，繞心臟旋轉(zhuǎn) 180°，每幀釆集 25 s，共釆集30幀，矩陣64×64，放大倍數(shù)2.0，釆用濾波反投影重建原始圖像。通過Emory Cardiac Toolbox軟件量化灌注質(zhì)量缺損百分率(MDP)及左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。以治療后與治療前灌注質(zhì)量缺損百分率的差值 (ΔMDP)評(píng)價(jià)灌注情況，LVEF的差值(ΔLVEF)評(píng)價(jià)心臟功能。

1.2.3.2 干細(xì)胞存活、分化及增殖情況 采用免疫熒光技術(shù)分析。術(shù)后6周靜脈注射1 g KCl處死動(dòng)物，取心肌梗死及交界區(qū)組織，制作冰凍切片。采用熒光顯微鏡觀察所標(biāo)記的熒光細(xì)胞(即干細(xì)胞)。組織切片分別以c-kit、c-TnT、vWF抗體作為一抗標(biāo)記，采用FITC標(biāo)記的抗兔二抗和Cy5標(biāo)記的抗小鼠二抗對(duì)切片進(jìn)行復(fù)染。采用IPP圖像處理軟件對(duì)圖像進(jìn)行疊加分析。

1.2.3.3 心肌細(xì)胞存活與凋亡情況 術(shù)后6周靜脈注射1 g KCl處死動(dòng)物，取心肌梗死及交界區(qū)組織，福爾馬林固定后行石蠟切片。以Masson三色法檢測(cè)存活心肌，以TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。采用IPP圖像處理軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以表示。采用多個(gè)樣本單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌灌注情況 移植組、對(duì)照組、PBS組ΔMDP分別為 -0.83% ±1.17%、4.33% ±1.86%、3.67% ±1.21%。移植組低于對(duì)照組及PBS組(P均＜0.01)。移植組、對(duì)照組、PBS組 ΔLVEF分別為1.00% ±3.22%、-9.17 ±2.48%、-9.33 ±2.73%，移植組低于對(duì)照組及PBS組(P均＜0.01)。

2.2 干細(xì)胞存活、分化及增殖情況 移植6周后移植組梗死交界區(qū)域內(nèi)可見CM-Dil陽性細(xì)胞。c-TnT與vWF染色中部分細(xì)胞呈陽性。除外源性植入的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外，梗死區(qū)域內(nèi)尚發(fā)現(xiàn)CM-Dil陰性而c-kit染色呈陽性的細(xì)胞，部分細(xì)胞c-TnT與vWF染色亦呈陽性。

2.3 心肌細(xì)胞存活與凋亡情況 Masson三色法染色結(jié)果應(yīng)用IPP軟件量化分析，移植組、對(duì)照組、PBS組心肌細(xì)胞存活量分別為(31391±4794)、(31520±4164)、(72271 ±4844)IOD/hpf。移植組明顯多于對(duì)照組及PBS組，P均＜0.01;即移植組交界區(qū)域存活心肌細(xì)胞明顯增多，對(duì)應(yīng)的纖維組織明顯減少。TUNEL染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)為(40±4)個(gè)cell/hpf，明顯少于對(duì)照組和PBS組的(82±5)和(79±5)個(gè) cell/hpf，P均 ＜0.01。

3 討論

雖然冠狀動(dòng)脈介入與搭橋術(shù)對(duì)急性心梗的治療效果良好，但術(shù)后常出現(xiàn)病理性心室重塑進(jìn)而引發(fā)心力衰竭，且迄今沒有有效的治療措施，甚至需通過器官移植才能恢復(fù)心臟功能［6，7］。分析其原因，主要是具有收縮功能的心肌細(xì)胞與營養(yǎng)心肌細(xì)胞的冠脈循環(huán)絕對(duì)不足。目前研究的目標(biāo)是找到適宜方法以替代心肌梗死細(xì)胞，預(yù)防或逆轉(zhuǎn)病理性心臟重塑。心血管再生醫(yī)學(xué)與干細(xì)胞療法成為當(dāng)前最具吸引力和前途的方法［8］。

間充質(zhì)干細(xì)胞是中胚層來源的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，廣泛存在于全身多種組織中。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是最早被分離出并被廣泛用于治療缺血性心臟病研究的成體干細(xì)胞。多項(xiàng)臨床前的大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠成功植入并分化為心肌和血管內(nèi)皮細(xì)胞［9～12］;亦能激活心肌干細(xì)胞生成新的心肌與血管結(jié)構(gòu)［13，14］。但隨著年齡增長，骨髓干細(xì)胞功能及生長、分化能力降低，端粒明顯變短［15］;加上抽吸骨髓為有創(chuàng)性操作、骨髓供體有限，均限制了同種異體骨髓干細(xì)胞的應(yīng)用［16］。相對(duì)于骨髓干細(xì)胞，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有取材簡便、組織來源豐富、細(xì)胞原始、增殖能力強(qiáng)、分化潛能大、免疫原性低、不誘發(fā)畸胎瘤、無病毒感染風(fēng)險(xiǎn)及倫理問題等優(yōu)點(diǎn)，是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的理想替代物［1］。

何紅燕等［3］將用BrdU標(biāo)記的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植至心肌梗死的大鼠心肌，2周后發(fā)現(xiàn)，移植細(xì)胞仍存活，且能表達(dá)心肌細(xì)胞標(biāo)記物心臟肌鈣蛋白I和T。Wu等［4］在體外試驗(yàn)和大鼠心梗模型中再次證實(shí)了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能向心肌細(xì)胞分化，超聲提示移植后2周和4周的左室功能較對(duì)照組改善。Latifpour等［5］觀察到，結(jié)扎 LAD 后30 d，接受人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療的家兔的左室射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率明顯改善，瘢痕含量顯著減低;組織病理學(xué)分析顯示，鄰近和遠(yuǎn)離梗死區(qū)域的植入細(xì)胞表達(dá)肌鈣蛋白I、actin和connexin-43，在梗死區(qū)內(nèi)亦可見少數(shù)移植的細(xì)胞。

本研究結(jié)果顯示，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞植入小型豬急性梗死心肌后6周仍然存活，其中部分干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。與其他兩組相比，移植組心肌缺血區(qū)域內(nèi)亦存在較多的CM-Dil陰性、c-kit陽性的心肌干細(xì)胞(CSCs)。在外源性干細(xì)胞的刺激下，CSCs在缺血區(qū)域募集并部分分化為新生的心肌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞，證實(shí)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可能通過外源性和內(nèi)源性再生兩個(gè)方面的機(jī)制參與心梗后損傷的修復(fù)，新生的心肌細(xì)胞可部分取代梗死細(xì)胞而發(fā)揮組織修復(fù)功能。

研究證實(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌機(jī)制對(duì)心梗后損傷的修復(fù)亦具有重要作用。有學(xué)者對(duì)臍帶和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長因子分泌譜進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可更強(qiáng)地表達(dá)數(shù)種直接或間接地與血管生成有關(guān)的生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子-D(VEGF-D)、血小板衍生的生長因子(PDGFAA)、轉(zhuǎn)化生長因子-β2(TGF-β2)、堿性成纖維生長因子(bFGF)和肝細(xì)胞生長因子(HGF)［17］。提示臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可能更適用于治療缺血性病變。鑒于HGF和bFGF被報(bào)道具有抗纖維化的作用［18］，因此提示臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可用于預(yù)防或減輕纖維化。本研究結(jié)果亦證實(shí)了上述觀點(diǎn)。

本研究結(jié)果提示，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增后經(jīng)心外膜直接注射植入，可在小型豬心梗模型的心肌梗死區(qū)域部分存活并分化為心肌和血管組織;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可促進(jìn)固有心肌干細(xì)胞的募集和分化，減少細(xì)胞凋亡和組織纖維化，抑制心室重塑的發(fā)生，改善梗死區(qū)域的心肌灌注和心室功能。

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