厚樸提取物對(duì)大鼠CYP2D6亞型酶的影響

于衛(wèi)江，張 斌，張文周

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院河南省腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，河南鄭州，450008)

厚樸為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalis Rehd.et Wils.或凹葉厚樸 Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮，性苦、辛，溫，歸脾、胃、肺、大腸經(jīng)，主治燥濕消痰，下氣除滿，用于濕滯傷中，脘痞吐瀉，食積氣滯，腹脹便秘，痰飲喘咳［1］。厚樸提取物主要成分是厚樸酚與和厚樸酚，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抑制潰瘍、抗炎、鎮(zhèn)痛及中樞穩(wěn)定等多種藥理作用［2］。經(jīng)體外篩選試驗(yàn)［3］顯示，厚樸提取物能夠抑制CYP2D6亞型酶的活性。本實(shí)驗(yàn)通過高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定大鼠尿液和肝微粒體重組系統(tǒng)中CYP2D6的探針?biāo)幬镉颐郎撤?DM)的代謝率，皆在探討厚樸提取物在體內(nèi)對(duì)CYP2D6亞型酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:成年雄性Wistar大鼠16只，體質(zhì)量(200±20)g。

藥品與試劑:DM、去甲右美沙芬(DX)、β－葡萄糖醛酸酶、己烷磺酸鈉購于Sigma公司;厚樸提取物購自寧波市中藥制藥廠;內(nèi)標(biāo)丁丙諾啡購于中國藥品生物制品檢定所。

主要儀器:Waters Empower 2010色譜管理系統(tǒng)(717自動(dòng)進(jìn)樣器，616泵，470熒光檢測(cè)器);高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司)，SHZ－82水浴恒溫振蕩器(江蘇金壇市科興儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn):將大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組8只，2組大鼠分別給予生理鹽水1 mL和1.0 g/kg的厚樸提取物，連續(xù)1周，第8天時(shí)給予2組大鼠6 mg/kg的DM，并留置代謝籠收集8 h尿液后，大鼠斷頭處死(處死前禁食24 h)。取尿樣和肝臟，分別置 －20℃和 －80℃冰箱保存。

1.2.2 DX與DM濃度的測(cè)定:用HPLC測(cè)定尿樣中DX與DM濃度，用二者之間的比率(DX/DM)，即DM代謝率表示CYP2D6亞型酶的活性。通過比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間DM代謝率，確定厚樸提取物對(duì)CYP2D6亞型酶活性的影響。

1.2.3 尿樣處理:取1 mL尿樣，加入2 mmol/L內(nèi)標(biāo)溶液丁丙諾非50 μL，pH 5.0醋酸鈉緩沖液1 mL，混旋0.5 min，置于37℃水浴水解14 h，加入3 mL提取液正己烷∶正丁醇(9∶1)，3 mol/L氫氧化鈉1 mL，混旋5 min，3 000×g離心5 min。取出上層有機(jī)相2 mL置具塞離心管中，加入0.01 mol/L 鹽酸200 μL 混旋3 min，3 000×g離心5 min，小心取下層水相20 μL進(jìn)樣分析。

1.2.4 肝微粒體制備:肝組織經(jīng)剪碎、漂洗、吸干后稱重，按1∶4(V∶V)加入勻漿緩沖液(50mmol/L Tris，質(zhì)量濃度為 11.5 g/L KCl，HCl調(diào) pH 至7.4)，冰浴;用玻璃勻漿器制成肝勻漿，4℃下9 000×g離心20 min，取上清液轉(zhuǎn)移至超速離心管內(nèi)4℃下100 000×g離心60 min;沉淀即為肝微粒體，重懸于0.25 mol/L蔗糖溶液中，分裝，置－80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 肝微粒體體外溫孵系統(tǒng):溫孵反應(yīng)體系中肝微粒體蛋白濃度1 mg/mL，NADP+1 mol/L，異檸檬酸鈉2 0 0 mmol/L，異枸櫞酸脫氫酶10 U/mL，MgCl210 mmol/L，探針?biāo)幬镉颐郎撤?.3 mmol/L，以0.1 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)定容至 500 μL，加入 NADP+開始反應(yīng)。37℃水浴中孵化40 min，加入50 μL冰冷的三氯醋酸終止反應(yīng)。

1.2.6 肝微粒體樣品處理:于500 μL溫孵反應(yīng)液中加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液丁丙諾非(2 mmol/L)，3 mmol/L 氫氧化鈉 100 μL，2.0 mL 正己烷∶正丁醇(9∶1，V∶V)，混懸振蕩5min提取，3000×g離心5 min;取上層有機(jī)相2 mL置具塞離心管中 ，加 入0.0 1 mmol/L鹽 酸1 5 0 μL混 旋3 min，3 000×g離心5 min;取下層水相20 μL進(jìn)樣分析。

1.2.7 同濃度厚樸提取物和西咪替丁抑制力比較:取實(shí)驗(yàn)組大鼠肝微粒體，根據(jù)加入藥品不同將其分為對(duì)照組、厚樸提取物組和西咪替丁組。對(duì)照組溫孵反應(yīng)體系同上述，后2組在其溫孵反應(yīng)體系中分別加入厚樸提取物(0.1 mg/mL)和西咪替丁(0.1 mg/mL)，孵化條件和色譜條件同上，測(cè)定3組大鼠肝微粒體中DX與DM濃度，比較3組DM代謝率。

1.2.8 色譜條件［4］:尿樣色譜條件為色譜柱:Hypersil－C6H5柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm，大連依利特公司)，室溫下測(cè)定，EX=280 nm，EM=310 nm。流動(dòng)相:0.01 mol/L磷酸二氫鉀:0.01 mol/L己烷磺酸鈉∶乙腈∶甲醇(33∶33∶80∶54，V∶V)，pH4.0，流速 1.0 mL/min。肝微粒體色譜條件流動(dòng)相變?yōu)?.01 mol/L磷酸二氫鉀:0.01 mol/L己烷磺酸鈉:乙腈:甲醇(33∶33∶100∶94，V∶V)，其余同尿樣。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠尿樣中DM代謝率比較

實(shí)驗(yàn)組大鼠尿樣中DM代謝率為55.04±25.90，明顯低于對(duì)照組(160.75 ±31.06)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 2組大鼠體外肝微粒體中DM代謝率比較

實(shí)驗(yàn)組大鼠體外肝微粒體中DM代謝率為0.014 ±0.007，明顯低于對(duì)照組(0.042 ±0.014)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。

2.3 3組肝微粒體中DM代謝率比較

厚樸提取物組肝微粒體中DM代謝率為0.010 ±0.003，顯著低于西咪替丁組(0.043 ±0.015)和對(duì)照組(0.069 ±0.020)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而西咪替丁組和對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

細(xì)胞色素P450是一個(gè)復(fù)雜的酶系統(tǒng)，由其參與的生物轉(zhuǎn)化是藥物代謝的重要環(huán)節(jié)，同時(shí)許多藥物又對(duì)細(xì)胞色素P450酶系的活性有抑制和誘導(dǎo)作用，從而導(dǎo)致臨床藥物的相互作用［4］。中藥厚樸藥理作用廣泛，臨床應(yīng)用較多，采用厚樸配方的中西成藥多達(dá)200余種，常用制劑包括藿香正氣水、麻仁丸、香砂養(yǎng)胃丸等［5］。很多OTC藥品含有厚樸成分，因此研究厚樸對(duì)細(xì)胞色素P450的影響，對(duì)于促進(jìn)臨床合理用藥尤其是中西藥物合并使用的安全性具有一定指導(dǎo)意義。

本研究HPLC檢測(cè)法在黃麗軍等［6］的實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上完成，在體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分析探討了厚樸提取物對(duì)CYP2D6亞型酶的影響，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組大鼠尿樣及體外肝微粒體種DM代謝率均明顯低于對(duì)照組，說明長(zhǎng)期應(yīng)用厚樸提取物可有效抑制CYP2D6 亞型酶的活性［7－11］。因此在使用羥考酮、異丙嗪、曲馬朵等經(jīng)CYP2D6亞型酶代謝藥物，且同時(shí)應(yīng)用含厚樸制劑時(shí)，應(yīng)注意因代謝減慢而出現(xiàn)的不良反應(yīng)。

具有抑制CYP2D6作用的藥物包括奎尼丁、特比奈芬、西咪替丁、美沙酮、利托那韋、咪康唑和吳茱萸次堿等［12－17］，而本研究選擇了一種經(jīng)典抑制劑西咪替丁，其在體外可抑制厚樸提取物誘導(dǎo)的大鼠肝微粒體重組系統(tǒng)DM的代謝。結(jié)果表明，厚樸提取物組肝微粒體中DM代謝率顯著低于西咪替丁組和對(duì)照組，說明在抑制CYP2D6亞型酶的活性方面，厚樸提取物的能力明顯優(yōu)于西咪替丁。

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