小G蛋白R(shí)ab40a的亞細(xì)胞定位及功能研究

張 蕾，常 宏，徐 東

（1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院心臟中心，北京100053；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)課教學(xué)部生物化學(xué)教研室，河北石家莊050091）

·論 著·

小G蛋白R(shí)ab40a的亞細(xì)胞定位及功能研究

張 蕾1，常 宏2*，徐 東1

（1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院心臟中心，北京100053；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)課教學(xué)部生物化學(xué)教研室，河北石家莊050091）

目的研究小G蛋白R(shí)ab40a的亞細(xì)胞定位及參與的細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸路徑。方法應(yīng)用共聚焦顯微鏡技術(shù)，研究綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記的Rab40a在Hela細(xì)胞內(nèi)與各種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，特別是轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡的共定位。利用RNA沉默技術(shù)研究Rab40a可能參與的細(xì)胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過程。結(jié)果Rab40a與高爾基標(biāo)記蛋白Golgin-97、內(nèi)吞體標(biāo)記蛋白EEA1存在共定位；干擾Rab40a表達(dá)明顯阻斷了霍亂毒素B自內(nèi)吞體向高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)。結(jié)論Rab40a定位于細(xì)胞內(nèi)吞體和高爾基體，參與細(xì)胞內(nèi)內(nèi)吞體到高爾基體之間的轉(zhuǎn)運(yùn)。

GTP結(jié)合蛋白類；脂質(zhì)體；RNA干擾

真核細(xì)胞各細(xì)胞器之間通過囊泡運(yùn)輸和微管系統(tǒng)進(jìn)行物質(zhì)的交換和信息傳遞，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、發(fā)育、分裂及細(xì)胞與細(xì)胞間的物質(zhì)交換。小G蛋白，包括Ras、Raf、Arf、Rho和Rab等廣泛參與這一過程。其中最大的亞家族，Rab家族目前已確定的成員超過60個(gè)，在囊泡的形成、轉(zhuǎn)運(yùn)、黏附、錨定和融合等過程中起重要作用［1－3］。在本實(shí)驗(yàn)室另一項(xiàng)關(guān)于GPR30的研究中，我們發(fā)現(xiàn)Rab40a與GPR30相互作用。而人Rab40a的功能卻未見報(bào)道。為此，我們利用共聚焦顯微鏡和RNA沉默技術(shù)，尋找RAB40a可能參與的細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸路徑。

1 材料與方法

1．1 材料：大腸桿菌JM109購自Promega公司，為河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)課教學(xué)部生物化學(xué)研究室保存。DNA重組所用限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，PCR相關(guān)試劑，膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒均購自TAKARA公司。細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清，轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000購自Invitrogen。引物合成及測序由華大基因公司完成。兔抗GFP多克隆抗體，鼠抗人EEA1，Rab5，Rab11單克隆抗體購自Santa Cruz公司。鼠抗人Golgin-97單克隆抗體，HRP-羊抗兔抗體，Alexa594-羊抗鼠抗體，Mitotracker，Lysotracker購自Invitrogen。

1．2 方法

1．2．1 GFP-Rab40a重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定：根據(jù)Rab40a（NM-080879）編碼序列合成上下游引物并引入合適的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，引物為Rab40a-F（5′-CGGAATTCGATGTGAGCGCCCCGGGCAGC-3′）和Rab40a-R（5′-CGGGATCCTTAAGAAATTTTGCAGCT-3′），下劃線處分別為EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增Rab40a全長，PCR產(chǎn)物經(jīng)回收與eGFP-C1載體同時(shí)用EcoRI與BamHI雙酶切，酶切產(chǎn)物回收后以T4DNA連接酶連接，重組質(zhì)粒GFPRab40a以測序鑒定。

1．2．2 Western Blot檢測：GFP-Rab40a轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞，24h后以去污裂解液裂解細(xì)胞。取20μg蛋白上樣進(jìn)行10％SDS-PAGE電泳。轉(zhuǎn)膜后，封閉（TBS＋5％脫脂奶粉），加一抗GFP（1∶2 000），二抗HRP-羊抗兔抗體（1∶10 000），洗膜后X線片曝光。

1．2．3 細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：Hela細(xì)胞在放入24孔板的玻片上進(jìn)行培養(yǎng)達(dá)70％～90％融合。在25μL無血清DMEM培養(yǎng)基中加入0.5μg質(zhì)粒，在另一管25μL無血清DMEM培養(yǎng)基中加入lipofectamine 2000 1μL，5min后，將兩管混合置于室溫，20min后加入細(xì)胞培養(yǎng)液中。24h后取出玻片，進(jìn)行免疫熒光染色。

1．2．4 免疫熒光染色：細(xì)胞經(jīng)4％多聚甲醛固定15min，PBS洗滌3遍去掉多余的多聚甲醛，加入封閉液（10％馬血清＋PBS）封閉1h，加入一抗室溫1h，PBS洗3遍，然后加入熒光二抗，室溫0.5h，PBS洗3遍后在共聚焦顯微鏡下觀察。

1．2．5 RNA沉默和脈沖追蹤（pulse and chase）：將干擾RNA以無菌水稀釋至終濃度20μmol/L。Hela細(xì)胞在放入24孔板的玻片上進(jìn)行培養(yǎng)達(dá)50％～70％融合。在25μL無血清DMEM培養(yǎng)基中加入1μL干擾RNA，在另一管25μL無血清DMEM培養(yǎng)基中加入lipofectamine 2000 2μL，5min后，將兩管混合置于室溫，20min后加入細(xì)胞培養(yǎng)液中。24h后細(xì)胞分離傳代，再過48h后，加入Alexa 594-標(biāo)記的霍亂毒素B（5mg/L）或Alexa 594-標(biāo)記轉(zhuǎn)鐵蛋白（30mg/L），冰上30min，換培養(yǎng)液洗3遍，加入10倍濃度的無標(biāo)記的霍亂毒素B或轉(zhuǎn)鐵蛋白，37C 30min，取出玻片，進(jìn)行免疫熒光染色。RNA沉默的效果以RT-PCR進(jìn)行檢測，引物為Rab40a-F（5′-GGGGATCGACTACAAGACGACC-3′）和Rab40a-R（5′-AGGTGT-GCAGGACACG-3′）。

2 結(jié) 果

2．1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定：重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI與 BamHI酶切，有約830bp片段插入。測序表明插入片段與Rab40a開放閱讀框序列完全相符，無堿基突變和缺失，插入方向正確，未發(fā)生讀碼框架改變。

2．2 Western Blot檢測GFP-Rab40a在Hela細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)：利用GFP抗體檢測顯示，在轉(zhuǎn)染GFPRab40a的細(xì)胞內(nèi)，有一條約50 000條帶，符合預(yù)測的融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小，而未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞無此條帶。

2．3 GFP-Rab40a的細(xì)胞內(nèi)定位：GFP-Rab40a轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞，用多聚甲醛固定，Triton X-100打孔，進(jìn)行免疫熒光染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Rab40a與高爾基標(biāo)記蛋白Golgin-97、內(nèi)吞體標(biāo)記蛋白EEA1存在共定位。而其他細(xì)胞器標(biāo)記蛋白（線粒體，溶酶體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）不與Rab40a共定位（圖1）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Rab40a與Rab5a、Rab11a存在共定位，提示其功能可能與內(nèi)吞體轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)（圖2）。

2．4 Rab40a沉默對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)挠绊懀篟TPCR顯示，轉(zhuǎn)染Rab40a干擾RNA的Hela細(xì)胞較轉(zhuǎn)染對(duì)照無功能小RNA的細(xì)胞，Rab40a表達(dá)明顯降低。轉(zhuǎn)鐵蛋白的脈沖追蹤（pulse-chase）實(shí)驗(yàn)顯示，干擾Rab40a表達(dá)并不對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸產(chǎn)生明顯影響。細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)鐵蛋白經(jīng)過30min脈沖追蹤，在對(duì)照組與Rab40a干擾組，均到達(dá)微管組織中心，即循環(huán)內(nèi)吞體集中區(qū)域。而霍亂毒素B的脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)表明，干擾Rab40a表達(dá)明顯阻斷了霍亂毒素B自內(nèi)吞體向高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)，在30min后，干擾組的霍亂毒素B仍散在分布于內(nèi)吞體，而對(duì)照組已集中在高爾基體（圖3）。

3 討 論

Rab蛋白家族中，Rab40a的功能尚未見報(bào)道。已進(jìn)行功能研究的Rab家族成員，均特異地參與細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸?shù)牟煌A段，如Rab1參與新合成蛋白由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)［4］，而Rab5、Rab4、Rab11組成質(zhì)膜→早期內(nèi)吞體→循環(huán)內(nèi)吞體→質(zhì)膜運(yùn)輸路徑［5］。在尋找可能與Rab40存在共定位的蛋白過程中，我們首先發(fā)現(xiàn)了早期內(nèi)吞體標(biāo)記蛋白EEA1，這提示Rab40a參與早期內(nèi)吞體的運(yùn)輸。但是，早期內(nèi)吞體囊泡內(nèi)的蛋白，會(huì)經(jīng)歷不同的命運(yùn)。一部分會(huì)經(jīng)由循環(huán)內(nèi)吞體重新轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上，如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體；一部分會(huì)演變?yōu)橥砥趦?nèi)吞體→溶酶體，蛋白最終被水解，如生長因子受體；還有一部分會(huì)被運(yùn)送至高爾基體，如霍亂毒素［6－7］。而自高爾基體出芽生成的囊泡，也會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)吞體，如CIMPR與CD-MPR［8］。

由于Rab40a與高爾基體蛋白Golgin-97也存在部分共定位，因此我們重點(diǎn)比較了Rab40a對(duì)內(nèi)吞體→細(xì)胞膜與內(nèi)吞體→高爾基體2種路徑的影響。結(jié)果表明，Rab40a不參與內(nèi)吞體→細(xì)胞膜路徑蛋白運(yùn)輸，而是參與了內(nèi)吞體→高爾基體路徑。有報(bào)道Rab11也參與了這一途徑，這與我們發(fā)現(xiàn)Rab40a與Rab11存在共定位相吻合［9］。需要指出的是，Rab40a尚無系統(tǒng)的研究報(bào)道，所以商品化的抗體尚未面世。我們目前的研究，是以GFP融合蛋白示蹤Rab40a的細(xì)胞內(nèi)分布。這一方法在Rab家族蛋白的研究中被廣泛應(yīng)用。但亦有報(bào)道指出個(gè)別Rab蛋白，其內(nèi)源分子與過表達(dá)分子的細(xì)胞定位存在較大差異［10］。因此，Rab40a抗體的制備，對(duì)將來進(jìn)一步闡明RAab40a的生物學(xué)功能至關(guān)重要。由于Rab蛋白功能損傷或基因突變會(huì)導(dǎo)致很多疾病，如免疫缺陷、癌癥以及神經(jīng)紊亂［11］，故闡明每一個(gè)Rab蛋白在細(xì)胞內(nèi)確切參與的運(yùn)輸路徑，對(duì)認(rèn)識(shí)這些疾病的病理過程有重要意義。（本文圖見封三）

［1］PEREIRA-LEAL JB，SEABRA MC.Evolution of the Rab family of small GTP-binding proteins［J］.Mol Biol，2001，313（4）：889－901.

［2］STENMARK H.Rab GTPases as coordinators of vesicle traffic［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2009，10（8）：513－525.

［3］GROSSHANS BL，ORTIZ D，NOVICK P.Rabs and their effectors：achieving specificity in membrane traffic［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（32）：11821－118127.

［4］SARASTE J，LAHTINEN U，GOUD B.Localization of the small GTP-binding protein rab1p to early compartments of the secretory pathway［J］.Cell Sci，1995，108（4）：1541－1552.

［5］ULLRICH O，REINSCH S，URBE S，et al Rab11 regulates recycling through the pericentriolar recycling endosome［J］.Cell Biol，1996，135（4）：913－924.

［6］BONIFACINO JS，ROJASR.Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2006，7（8）：568－579.

［7］MOHRMANN K，VAN DER SLUIJS P.Regulation of membrane transport through the endocytic pathway by rabGTPase［J］.Mol Membr Biol，1999，16（1）：81－87.

［8］SCOTT GK，F(xiàn)EI H，THOMAS L，et al.A PACS-1，GGA3 and CK2 complex regulates CI-MPR trafficking［J］.EMBO J，2006，25（19）：4423－4435.

［9］WILCKEM，JOHANNES L，GALLI T，et al.Rab11 regulates the compartmentalization of early endosomes required for efficient transport from early endosomes to the trans-golgi network［J］.J Cell Biol，2000，151（6）：1207－1220.

［10］RZOMPKA，SCHOLTESLD，BRIGGSBJ，etal.Rab GTPases are recruited to chlamydial inclusions in both a species-dependent and species-independent manner［J］.Infect Immun，2003，71（10）：5855－5870.

［11］AGOLA J，JIM P，WARD H，et al.Rab GTPases as regulators of endocytosis，targets of disease and therapeutic opportunities［J］. Clin Genet，2011，80（4）：305－318.

（本文編輯：劉斯靜）

SUBCELLAR LOCALIZATION AND FUNCTIONAL STUDY OF SMALL GTPase Rab40a

ZHANG Lei1，CHANG Hong2*，XU Dong1
（1．Department of Cardiology，Xuanwu Hospital of Capital Medical University，Beijing 100053，China；2．Department of Biochemistry，the School of Basic Medical Sciences，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050091，China）

Objective To study the subcellular localization and intracellular vesicle transport pathway which small GTPase Rab40a is involved in.MethodsThe colocalization of green fluorescent protein（GFP）labeled Rab40a with subcellular structures，especially transport vesicles in Hela cellswas observed by confocal microscopy.The intracellular vesicular transport pathways which Rab40a may be involved in was studied by using RNA silencing technology.ResultsRab40a was colocalized with endosome and Golgimarker proteins，EEA1 and Golgin-97.Interfering Rab40a blocked the transportation of cholera toxin B from endosome to Golgi.ConclusionRab40a is localized in endosome and Golgi and participates intracellular transport from endosome to Golgi.

GTP-binding proteins；liposomes；RNA interference

R341

A

1007-3205（2013）05-0512-03

2013－02－25；

2013－04－02

張蕾（1974－），女，湖北武漢人，首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事影像學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)診斷研究。

*通訊作者。E-mail：ch720321＠126.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.05.006