兔心房組織L型鈣通道表達(dá)的增齡性變化及卡托普利的干預(yù)作用

韓新源，陳春燕，壽錫凌，程 功，潘軍強(qiáng)，孫超峰(陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)科，西安 70068;西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科;通訊作者，E-mail:csunl@63.com)

心房顫動(dòng)(房顫)是臨床上最常見(jiàn)的心律失常之一，其發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，增齡成為房顫發(fā)生的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素［1］。但增齡性房顫的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全明確。心房電重構(gòu)是房顫發(fā)生和維持的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，房顫時(shí)L型鈣通道的變化在電重構(gòu)過(guò)程中發(fā)揮重要作用［2］。隨著衰老的過(guò)程，L型鈣通道在心房表達(dá)是否會(huì)隨著年齡改變而改變，目前尚不清楚。藥物治療是目前房顫治療最主要的方式，而傳統(tǒng)的抗心律失常藥物由于其同時(shí)具有致心律失常的問(wèn)題，在房顫治療中的地位備受爭(zhēng)議。鑒于此，房顫的上游治療即改善房顫基質(zhì)越來(lái)越受到重視［3］。房顫發(fā)生和維持基質(zhì)主要是心房重構(gòu)，已有大量研究證實(shí)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAS)的激活與房顫心房重構(gòu)的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，RAS抑制劑可以降低房顫的發(fā)生率［4］。因此，本研究通過(guò)觀察不同年齡段家兔心房組織L-型鈣通道表達(dá)的增齡性改變，以及卡托普利對(duì)老年家兔心房組織L-型鈣通道表達(dá)的影響，來(lái)初步探討增齡性房顫發(fā)生機(jī)制及防治策略。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組及給藥

健康家兔分為三組:成年組(4-6月齡)、老年組(30-34月齡)、老年干預(yù)組(30-34月齡)，每組8只。老年干預(yù)組以卡托普利5.5 mg/(kg·d)(商品名:開(kāi)博通，百時(shí)美施貴寶公司生產(chǎn))用生理鹽水稀釋后灌胃給藥8周;老年組以等容量的生理鹽水灌胃8周。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 體表心電圖檢測(cè)

家兔麻醉后，記錄體表Ⅱ?qū)碾妶D，采用分析軟件測(cè)量心率(HR)和P波時(shí)限，包括最大P波時(shí)限(Pmax)、最小 P波時(shí)限(Pmin)，計(jì)算 P波離散度(Pd)、P波平均時(shí)限(Pa)。

1.3 心房組織AngⅡ的測(cè)定

稱(chēng)取100 mg的心房組織，將組織加入適量的生理鹽水搗碎。2 000×g離心10 min，取上清液。采用兔(Rabbit)血管緊張素Ⅱ(ANG-Ⅱ)ELISA檢測(cè)試劑盒(R＆D公司，美國(guó))測(cè)定心房組織AngⅡ的含量，實(shí)驗(yàn)按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄及real-time PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)

取100 mg左心耳組織，用Trizol(Invitrogen公司，美國(guó))一步法提取總RNA。應(yīng)用紫外光分析的方法檢測(cè)所提取的總RNA的濃度及其OD260mm/OD280mm的比值，所有樣本的 OD260mm/OD280mm值在1.8-2.0之間。cDNA合成:取2 μg總RNA參照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物公司)進(jìn)行操作逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。②引物由北京三博遠(yuǎn)志生物科技公司合成，序列如下:L-Ca α1C:上游:5’-GACTCCACTTTCACCCCC-3’，下游:5’-TCTCCCCCTTGATTCTTCTGCC-3’;GAPDH:上 游:5’-GCTTTTAACTCTGGCAAAGTG-3’，下游:5’-GATGATGACCCTTTTGGCTC-3’。按照TaKaRa real-time PCR試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行反應(yīng)，采用兩步法PCR擴(kuò)增程序，第一步預(yù)變性95℃ 30 s 1個(gè)循環(huán)，第二步PCR反應(yīng)95℃ 5 s，59.5℃ 30 s 40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增曲線完成后自動(dòng)生成融解曲線，反應(yīng)完成后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和融解曲線。根據(jù)Bio-Rad iQ5 Realtime PCR儀軟件得出各個(gè)樣本的Ct值，按照2-ΔΔCt法計(jì)算各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

提取組織中總蛋白并檢測(cè)總蛋白含量:取20 μl樣品/泳道上樣于10%SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳;4℃電轉(zhuǎn)膜90 min。TBST封閉1 h，洗脫后加入一抗1∶800(抗 L-Ca α1C，Abcam)及內(nèi)參 1∶1 000(抗 βactin，Santa Cruz)，4℃過(guò)夜。TBST漂洗 10 min×3次后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶10 000，Santa Cruz)室溫孵育1 h后加入 ECL(Pierce)發(fā)光底物顯色。用Quantity One凝膠圖像分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，根據(jù)目的蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值得到各目標(biāo)蛋白相對(duì)含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

研究數(shù)據(jù)以Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有資料用±s描述，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)后，正態(tài)分布資料兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組兔體表心電圖P波平均時(shí)限以及P波離散度的比較

成年組P波平均時(shí)限為(33.2±5.1)ms，老年組P波平均時(shí)限為(46.9±7.6)ms，較成年組延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。成年組P波離散度為(8.2±1.8)ms，老年組P波離散度為(15.1±2.7)ms，較成年組P波離散度增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)?？ㄍ衅绽深A(yù)組與老年組相比，P波平均時(shí)限以及P波離散度均縮短分別為(39.7±6.8)ms和(11.8±2.1)ms，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 各組兔心房組織AngⅡ含量的比較

實(shí)驗(yàn)8周后測(cè)得成年組心房組織AngⅡ含量明顯低于老年組(P＜0.01);卡托普利干預(yù)組與老年組相比，心房組織AngⅡ含量明顯降低(見(jiàn)圖1)。

圖1 各組兔心房組織AngⅡ含量比較Figure 1 Comparison of atrial AngⅡlevel among three groups

2.3 各組兔L型鈣離子通道α1C亞基基因和蛋白表達(dá)的比較

2.3.1 L型鈣離子通道α1C亞基基因表達(dá)比較老年組L型鈣通道α1C亞單位基因表達(dá)為1.01±0.35，低于成年組的2.32±0.24(P＜0.01);老年干預(yù)組較老年組L型鈣通道α1C亞單位基因表達(dá)明顯上調(diào)(1.86±0.49，P ＜0.05，見(jiàn)圖2)。

2.3.2 L型鈣離子通道α1C亞基蛋白表達(dá)比較老年組L型鈣通道α1C亞單位蛋白表達(dá)明顯低于成年組(0.43±0.12 vs 0.96±0.22，P＜0.01);而卡托普利干預(yù)后(0.69±0.16)蛋白表達(dá)較老年組明顯增加(P＜0.05，見(jiàn)圖3)。

圖2 三組L-Ca α1C mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較Figure 2 Relative expression of L-Ca α1C mRNA in three groups

圖3 三組L-Ca α1C蛋白表達(dá)量比較Figure 3 The expression levels of L-Ca α1C protein in three groups

3 討論

本研究結(jié)果顯示，隨著年齡的增加，Pa延長(zhǎng)，Pd增大，心房組織AngⅡ的含量增加，L型鈣通道α1C亞單位蛋白以及基因表達(dá)均呈現(xiàn)增齡性的減少，這些改變可能為增齡性房顫的發(fā)生提供基質(zhì)。服用卡托普利干預(yù)后，Pa、Pd縮短，心房組織AngⅡ的含量降低，而L型鈣通道α1C亞單位表達(dá)均增加。說(shuō)明卡托普利可以抑制RAS激活，可能在一定程度上逆轉(zhuǎn)心房組織電重構(gòu)，預(yù)防增齡性房顫的發(fā)生。

Pa延長(zhǎng)標(biāo)志著心房?jī)?nèi)傳導(dǎo)紊亂，與房顫發(fā)生率有很好的相關(guān)性。而Pd則是心房非均質(zhì)電活動(dòng)的離散程度的反映，Pd增大是房顫發(fā)生的預(yù)測(cè)因子［5］。本研究發(fā)現(xiàn)與成年組比較，老年組Pa明顯延長(zhǎng)，Pd明顯增大，這一結(jié)果說(shuō)明Pa和Pd都呈現(xiàn)一種增齡性的變化，提示增齡可以導(dǎo)致心房傳導(dǎo)速度延長(zhǎng)。心房?jī)?nèi)傳導(dǎo)速度的這種增齡變化考慮可能與增齡過(guò)程中心房重構(gòu)逐漸增加進(jìn)而導(dǎo)致心房除極時(shí)間延長(zhǎng)及非均質(zhì)性電活動(dòng)的程度加重有關(guān)［6］。

近年的研究發(fā)現(xiàn)，心房電重構(gòu)在房顫的發(fā)生和維持中起著關(guān)鍵的作用。多種離子參與電重構(gòu)過(guò)程，其中最重要的是 L型鈣依賴(lài)電流 (ICaL)的變化［7］，它是房顫時(shí)動(dòng)作電位時(shí)程(APD)和有效不應(yīng)期(ERP)改變的主要原因［8］。而離子通道電流變化則是由通道數(shù)目的改變所致。L型鈣通道由α1、α2、β、δ、γ 五種亞單位組成，其中 α1C 亞單位是 L型電壓門(mén)控鈣通道蛋白的主要亞單位。van der Velden等［9］在山羊模型上觀察發(fā)現(xiàn)，與竇性心律相比，持續(xù)性房顫心房肌的α1C的mRNA表達(dá)顯著降低。張建成等［10］發(fā)現(xiàn)，持續(xù)性房顫患者細(xì)胞膜L型鈣通道α1C亞單位mRNA與蛋白的表達(dá)均明顯下調(diào)。李妙齡等［11］研究表明，在快速起搏心房6 h后心房L型鈣通道α1C亞單位mRNA表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)含量在隨后起搏過(guò)程中仍逐漸下降。以上研究結(jié)果說(shuō)明，L型電壓依賴(lài)型鈣通道數(shù)量下調(diào)可能是房顫心房電重構(gòu)的分子基礎(chǔ)，對(duì)房顫的維持和發(fā)展有重要作用。本研究結(jié)果顯示老年組心房組織L型鈣通道α1C亞單位的表達(dá)下調(diào)，這一改變可能是增齡引起心房電重構(gòu)的原因之一。Anyukhovsky等［12］在研究健康犬心房顫動(dòng)的易感性增齡性變化的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，老年犬較成年犬動(dòng)作電位平臺(tái)期顯著縮短、動(dòng)作電位時(shí)程顯著延長(zhǎng)。既往有研究發(fā)現(xiàn)，老年大鼠心室肌細(xì)胞的單相動(dòng)作電位時(shí)程MAPD均較青年大鼠明顯增大。增加刺激頻率后兩組MAPD的縮短程度不同，老年組的縮短明顯大于青年組。推測(cè)其機(jī)制可能是ICa-L隨著年齡的增長(zhǎng)而減小，動(dòng)作電位相應(yīng)的代償性地延長(zhǎng)，以維持細(xì)胞內(nèi)外Ca2+的平衡［13］。

已有大量的研究證實(shí)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的激活在房顫的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。AngⅡ是RAS的主要活性成分，對(duì)多種心肌的離子通道具有作用。研究表明，AT1受體能與Kv4.3結(jié)合形成復(fù)合物，AngⅡ可以促使該復(fù)合物向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，減少該通道在細(xì)胞膜的表達(dá)量，使Ito減?。?4］。此外，AngⅡ?qū)Ca-L也有調(diào)節(jié)作用，AngⅡ可以抑制ICa-L亮［15］。本研究顯示，老年組 AngⅡ含量較成年組明顯增加，而心房組織L型鈣通道α1C亞單位的表達(dá)較成年組明顯減少。此研究結(jié)果表明，增齡可以增加心房局部組織AngⅡ含量，可以減少L型鈣通道表達(dá)，而這些增齡所致的改變可能為增齡性房顫的發(fā)生提供基礎(chǔ)。RAS阻斷劑ACEI和ARB可以通過(guò)阻斷RAS的激活，減少AngⅡ的產(chǎn)生，從而改善心房的電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)，預(yù)防房顫的發(fā)生。Nakashima等［16］研究了卡托普利和 AT1受體拮抗劑坎地沙坦對(duì)心房快速起搏誘發(fā)的電重構(gòu)的影響，結(jié)果顯示卡托普利及坎地沙坦可有效預(yù)防快速起搏導(dǎo)致的AERP縮短。Laszlo等［17］在右房快速起搏前1周應(yīng)用依那普利，結(jié)果發(fā)現(xiàn)依那普利可以增加ICa-L亮的電流密度。本研究發(fā)現(xiàn)，老年組給予卡托普利干預(yù)后心房組織AngⅡ含量下降，Pa縮短，Pd減小，L型鈣通道α1C亞單位表達(dá)增加。卡托普利可能通過(guò)阻滯RAS激活，降低心房肌AngⅡ含量，逆轉(zhuǎn)增齡所致的L型鈣通道重構(gòu)，這一研究結(jié)果表明阻斷RAS激活可能成為治療增齡性房顫的一個(gè)新靶點(diǎn)。

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