哺乳動物DNA甲基化概述

何錦紅，蔣金航，2，馬 云＊

（1.信陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 動物遺傳實驗室，河南信陽464000；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州450002）

1942 年，Waddington 首次提出表觀遺傳學(xué)的概念，幾十年后，霍利迪針對表觀遺傳學(xué)提出了更新的系統(tǒng)性論斷，即在不改變基因組序列的前提下，通過DNA 和組蛋白的修飾來調(diào)控基因表達，這種修飾以DNA甲基化為常見［1］。但直到1988年Bestor T 等［2］由于發(fā)現(xiàn)編碼DNA甲基化的基因和酶，使人們認識到了DNA甲基化可能對基因的功能產(chǎn)生重大影響，以至于有關(guān)DNA甲基化的研究逐漸開展起來。本文主要介紹鼠、牛、豬這幾類哺乳動物與人DNA甲基化的最新研究進展，為相關(guān)研究資料提供參考。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，哺乳動物基因組在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的作用下把CpG 二核苷酸的S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體。將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶（mC）的一種反應(yīng)，在基因組的某些區(qū)域中CpG 序列密度很高，可以達均值的5倍以上，成為鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區(qū)，形成所謂的CpG 島。哺乳動物中，DNA甲基化主要發(fā)生在CpG 雙核苷酸序列的胞嘧啶上，它不僅可以影響細胞基因的表達，而且這種影響還可隨細胞分裂而遺傳［3］。在真核DNA 中，甲基化反應(yīng)模式有兩種：從頭甲基化和維持甲基化，甲基化模式的改變與維持與DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶密切相關(guān)。

2 DNA甲基化功能作用

DNA甲基化通過影響基因C→T 的突變、基因錯配修復(fù)、基因沉默等對哺乳動物發(fā)揮作用。研究表明胚胎的正常發(fā)育得益于基因組DNA 適當(dāng)?shù)募谆?。例如小鼠胚胎在發(fā)育過程中缺少一種甲基轉(zhuǎn)移酶，就會導(dǎo)致小鼠中期妊娠后將不能正常發(fā)育從而導(dǎo)致死亡［4］。胚胎干細胞分化上有研究表明胚胎干細胞的甲基化圖譜與正常體細胞存在很大差異，胚胎干細胞的分化通常伴隨DNA甲基化的改變，部分基因由非甲基化變?yōu)榧谆糠只蛴杉谆D(zhuǎn)變?yōu)榉羌谆?，證明了DNA甲基化參與了干細胞分化的調(diào)控［5］。克隆動物發(fā)育研究過程中，產(chǎn)生克隆動物的效率低和克隆動物的異常等現(xiàn)象中DNA甲基化異常重編程是克隆動物發(fā)育失敗的一個重要原因［6］。DNA甲基化在遺傳育種中影響雜種表現(xiàn)，在世代遺傳中DNA甲基化修飾作用不僅會貫穿生物體的整個發(fā)育過程，而且會遺傳下一代，進而影響子代的生長發(fā)育，基因組印記、X 染色體失活就是其重要的修飾表現(xiàn)。然而在人類的腫瘤疾病中DNA 的高甲基化或低甲基化異常導(dǎo)致腫瘤抑制基因失活，癌癥的發(fā)生發(fā)展就與DNA甲基化有著密切的聯(lián)系。

3 哺乳動物DNA甲基化

哺乳動物DNA甲基化研究涉及不同方向，重點概述鼠、牛、豬哺乳動物和人甲基化水平研究。

3.1 鼠DNA甲基化

生物試驗中常以鼠為材料獲得很多相關(guān)研究成果。DNA甲基化研究中申文雯等［7］以3 周齡～4周齡C57BL／6J雄性小鼠為材料隨機分3組，分別給予兩種高脂飼料n-6PUFAs（脂肪來源于葵花籽油）和n-3PUFAs（脂肪來源于魚油飼料）喂養(yǎng)14周，以正常脂飼料（脂肪來源于葵花籽油）為對照。喂養(yǎng)結(jié)束后，通過DNA 總甲基化定量試劑盒及ELISA 試劑盒檢測，發(fā)現(xiàn)高脂飼料誘導(dǎo)肥胖小鼠的脂肪組織DNA 總甲基化程度均明顯升高，小鼠體重升高。n-6PUFAs高脂飼料誘導(dǎo)肥胖小鼠的脂肪組織DNMT1、DNMT3a和DNMT3b 的表達均顯著高于正常脂飼料組小鼠，而n-3PUFAs高脂飼料喂養(yǎng)小鼠脂肪組織中這3種酶的表達無變化。結(jié)果表明肥胖狀態(tài)下脂肪組織基因組DNA甲基化程度升高；魚油n-3PUFAs具有抑制DNA甲基化的作用。王小莉等［8］以大鼠的胰島、胰島素瘤細胞（INS-1）及大鼠肝干細胞（WB）為材料通過對細胞培養(yǎng)、胰島的分離純化建立WB-PDX1（pancreatic duodenum homeobox protein-1）細胞系，采用重亞硫酸鹽測序法及焦磷酸測序法檢測得到大鼠胰島和INS-1 細胞中Ins1 基因高表達，啟動子區(qū)域的甲基化程度非常低，而在大鼠肺、脾、皮膚、小腸、脂肪、肝臟組織和WB 細胞中Ins1基因不表達，啟動子區(qū)域的甲基化程度很高。WB-PDX1細胞系中PDX1慢病毒可使Ins1 基因啟動子區(qū)域的甲基化程度降低，證明Ins1基因的表達受甲基化調(diào)控。高凱等［9］將大鼠隨機分為抑郁組和對照組并對前者進行21d慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激，通過動物行為學(xué)評定以及熒光定量PCR、蛋白免疫印跡和亞硫酸氫鹽修飾后測序檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑郁組行為學(xué)有所改變，mRNA 及蛋白質(zhì)表達升高，均與對照組有顯著差異，而DNA甲基化沒有明顯不同。慢性應(yīng)激后，CRHR1（促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素）表達上調(diào)，卻不是由DNA甲基化機制調(diào)控。

王麗君等［10］對雌性SD 大鼠受孕后2d～21d，給予不同劑量全氟辛烷磺酸（PFOS）灌胃染毒，子鼠出生后21d，收集肝臟，通過總甲基化檢測試劑盒等方法對DNA 總甲基化水平檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)總甲基化與出生前PFOS暴露水平相關(guān)，CPG 島甲基化狀態(tài)也與PFOS暴露水平相關(guān)。黃鋮鋮等［11］以SPF 級C57BL／6J雄性小鼠為材料使小鼠接受4Gy60Co-γ射線單次全身照射后，均眼球摘除取血后處死，收集各臟器組織，進行外周血白細胞計數(shù)和骨髓嗜多染紅細胞微核計數(shù)，并應(yīng)用一些先進技術(shù)方法檢測結(jié)果甲基化水平表明在電離輻射損傷中基因組啟動子甲基化模式發(fā)生了改變，DNMT1表達增加可能是導(dǎo)致啟動子發(fā)生甲基化的原因。丁濤等［12］以Wistar大鼠為實驗材料用卵白蛋白（OVA）致敏并激發(fā)的方法建立哮喘大鼠模型以免疫磁珠分離肺CD4＋T 細胞并進行純度鑒定。結(jié)果表明，哮喘大鼠肺CD4＋T 細胞Notch1 基因DNA 低甲基化可能參與了Notch1 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，增高了Notch1 基因的表達量，從而參與了哮喘的發(fā)病。Lee Y M 等［13］通過應(yīng)用DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dC（5-aza-2′-deoxycytidine，10μmol／L～5μmol／L）對小鼠胚胎進行實時定量（Q-PCR）處理，運用Megaplex（多業(yè)務(wù)接入復(fù)用器）對microRNAs（miRNAs）的改變分析得到5-aza-dC干預(yù)修飾microRNAs的概況，以及在小鼠桑椹胚至囊胚階段對象識別提供信息，用來探索生育以及microRNA 的調(diào)控和表觀遺傳干預(yù)之間的關(guān)系。

3.2 牛的DNA甲基化

陳潔等［14］利用亞硫酸氫鹽測序法通過對出生48h內(nèi)死亡的體細胞核移植牛和正常對照牛肺臟中印記基因Mash2（mammalian achaete-scute complex homologue-like2）的DNA甲基化狀態(tài)進行分析，結(jié)果表明Mash2基因的異常甲基化可能是導(dǎo)致克隆牛肺臟發(fā)育異常的一個重要原因。蘇建明等［15］通過亞硫酸氫鹽測序法和亞硫酸氫鹽聯(lián)合限制性內(nèi)切酶分析法對印跡基因PEG10（paternally expressed gene10）分析，以圍產(chǎn)期死亡轉(zhuǎn)基因克隆牛的胎盤（死亡組）和存活的轉(zhuǎn)基因克隆牛的胎盤（存活組）和正常對照牛胎盤（對照組）為材料，對其DNA甲基化水平進行了詳細比較，結(jié)果證明胎盤中印跡基因PEG10的DNA甲基化表觀重編程不徹底可能是導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因克隆牛發(fā)育異常進而死亡的主要原因之一。辛鵬慧等［16］利用RT-PCR 以及亞硫酸鹽測序PCR檢測法對成年牛組織中ZAR1（Zygote Arrest1）卵巢特異性母性效應(yīng)基因表達情況及DNA甲基化狀況進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNA甲基化與牛ZAR1基因的組織特異性表達相關(guān)。研究者還通過某些物質(zhì)之間的聯(lián)合作用對表觀遺傳狀態(tài)的影響做出試驗，胡廣衛(wèi)等［17］就通過將5-氮雜-2′-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）聯(lián)合曲古抑菌素A（TSA）運用熒光染色等方法對牛體外受精胚胎、正常體細胞、核移植胚胎等作用進行DNA甲基化和組蛋白乙酰化檢測，結(jié)論證明5-Aza-CdR聯(lián)合TSA 處理供體細胞和核移植胚胎改變核移植胚胎的DNA甲基化和組蛋白乙?；剑顾鼈兊谋碛^遺傳狀態(tài)及體外發(fā)育率更接近于體外受精胚胎。Ken-ichi等［18］為了積累評估克隆牛正常性能的信息對從克隆牛囊胚中獲得的衛(wèi)星一區(qū)的甲基化狀態(tài)分析結(jié)果提供有力的信息表明在克隆牛子代表觀遺傳狀態(tài)可能是正常的，表明著種系細胞在克隆牛上正常性。

3.3 豬的DNA甲基化

豬是家養(yǎng)哺乳動物中最常見的，對其DNA甲基化研究有著很大的生物學(xué)和經(jīng)濟學(xué)意義。豬是最接近人類的模式動物，為研究肥胖問題中國科學(xué)家首次構(gòu)建豬脂肪和肌肉DNA甲基化圖譜為預(yù)防人類肥胖疾病的發(fā)生和促進豬肌肉生長和脂肪沉積這一重要經(jīng)濟性狀的研究，奠定了重要的表觀遺傳學(xué)基礎(chǔ)。肖正中等［19］以長白豬、藍塘豬及其雜種為材料應(yīng)用甲基化敏感擴增多態(tài)性（MSAP）技術(shù)對其耳組織基因組DNA 胞嘧啶甲基化模式和程度進行評估，通過對其引物擴增檢測，3個豬群中DNA甲基化程度都高，親代和F1代甲基化水平有差異，由此可證明使用MSAP 技術(shù)檢測豬種基因組甲基化多態(tài)性非常有效，且豬基因組甲基化多態(tài)性豐富。白小青等［20］以榮昌豬為材料采用HPLC 法（色譜分析）分別檢測了榮昌豬閹公豬心臟、肝臟、半膜肌3種組織在10、20、35、50、80、100kg體質(zhì)量階段基因組DNA 的甲基化水平，得出體質(zhì)量階段是豬基因組DNA甲基化水平的重要影響因素之一。DNA的甲基化水平在肝臟與半膜肌間具有組織特異性，而在心臟與肝臟間、心臟與半膜肌間是否具有組織特異性與體質(zhì)量階段明顯相關(guān)。在胚胎發(fā)育上，李寧等［21］以豬體外受精（IVF）和胞漿內(nèi)單精注射（ICSI）胚胎為研究對象，采用real-time PCR 技術(shù)對其DNA甲基化相關(guān)基因（Dnmt1 和Dnmt3a）的表達進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胚胎發(fā)育過程中IVF與ICSI胚胎的抗凋亡基因白血病-2mRNA（Bcl-2mRNA）表達量均逐漸下降，且ICSI胚胎的下降趨勢較明顯，說明胚胎抑制凋亡的能力下降，有可能是影響胚胎發(fā)育的主要原因。Gao Fei等［22］對表型正常的克隆豬和控制豬在兩個組織（肌肉和肝臟）進行全基因組的基因表達和DNA甲基化分析，試驗結(jié)果表明表型正常的克隆豬與普通生育豬基因表達水平上高度的相同，克隆豬在這兩個組織的獨特序列的DNA甲基化顯示了不同的模式，說明適度的改變在DNA甲基化水平表現(xiàn)上仍然存在，特別是在某些特殊的基因區(qū)。

3.4 人的DNA甲基化

人類除了對其他種類的哺乳動物的研究自然也少不了對自身的研究，表觀遺傳中DNA甲基化對人類遺傳物質(zhì)的修飾作用、人的生長發(fā)育等健康方面起著非常重要的作用。李新等［23］以男性焦?fàn)t工人和供水廠工人為研究對象通過高效液相色譜法、彗星實驗檢測法、甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)分別對暴露指標(biāo)1-羥基芘（1-OH-Py）的水平，空腹肘靜脈血細胞中DNA 損傷情況，p16基因啟動子區(qū)CpG 島甲基化發(fā)生情況進行檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)周圍血p16基因異常甲基化可能是焦?fàn)t工人肺癌早期篩查有效的生物標(biāo)志物。丁肖華等［24］以臨床肝癌病理組織標(biāo)本、肝硬化組織標(biāo)本和正常對照組為材料通過亞硫酸氫鹽修飾后聚合酶鏈式測序法分析肝癌細胞株Hep G2 和外周血白細胞DNA 的甲基化模式差異并建立反向點雜交（RDB）檢測DNA甲基化方法，進行方法學(xué)評估證明RDB 可用于肝癌臨床早期檢查。陳培利等［25］從細胞形態(tài)和Southern印跡雜交測定端區(qū)長度兩方面觀察5-氮胞苷處理對人胚肺二倍體成纖維細胞衰老進程的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5-氮胞苷處理使老年細胞衰老表型更為突出，其端區(qū)長度縮短較年輕細胞更為顯著，結(jié)論顯示甲基化水平降低及其導(dǎo)致的端區(qū)縮短的共同作用可能在細胞衰老過程中發(fā)揮著重要的作用。艾軍華等［26］以人乳頭瘤病毒11型全核苷酸序列的CpG 基序進行分析通過從pBR322-HPV11 重組質(zhì)粒上酶切下來的HPV11全長DNA 進行計算機分析，并用限制性內(nèi)切酶PCR 法分析HPV11DNA 中CpG 基序的甲基化狀態(tài)，結(jié)果表明乳頭瘤病毒11 型DNA 中含有GACGTT 等非甲基化的CpG 基序，而且具有免疫原性。Li Y J等［27］通過運用甲基化量化工具對成年自身免疫糖尿病患者（LADA）和正常人的總體CD4＋T 細胞進行甲基化水平的檢測并通過對比得出來自于LADA 病人的DNA甲基化水平的改變導(dǎo)致疾病攻擊并影響自身免疫相關(guān)基因的表達的進展。當(dāng)然人類的探索也不僅僅是在這些方面，在癌癥、在人類基因組印記等方面都做出相當(dāng)好的研究成果，這些成果在某些疾病的治療上以及病理的解釋上提供了很好的指導(dǎo)。

4 展望

自從表觀遺傳學(xué)提出以來，人們就不斷的致力于研究DNA甲基化在生物體上的表觀遺傳影響。哺乳動物DNA甲基化的研究涉及到很多方面，包括哺乳動物的生長、發(fā)育。遺傳是一個復(fù)雜的過程其中DNA甲基化在基因表達調(diào)控中發(fā)揮著重要的機制，為真核細胞正常發(fā)育、分化所必需，并在腫瘤、癌癥等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此，對于甲基化的進一步深入研究必將有助于闡明某些疾病的發(fā)病機制，對臨床疾病的診斷做出巨大的貢獻，并為研究和治療提供新的方法與途徑，同時也為動物育種飼養(yǎng)等方面提供理論基礎(chǔ)，為人類帶來經(jīng)濟效益。

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