原癌基因Bcl-6研究進展

耿萬友，侯 睿，孫樹民，魯金波，杜立銀

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)動物科技學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028042）

B細胞淋巴瘤（B cell lymphoma，Bcl）家族基因在細胞凋亡調(diào)控過程中具有重要作用，目前已發(fā)現(xiàn)的該家族基因超過25種。其中，一類是促進細胞凋亡基因，包括Bax、Bak、Bok、Bcl-xS和Bad等，另一類是抑制細胞凋亡基因，包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Bfl-1和Brag-1 等。研究發(fā)現(xiàn)原癌基因Bcl-6 也屬于這一家族基因，具有抗細胞凋亡作用。本文將詳細闡述Bcl-6的基因結(jié)構(gòu)及分布、生物學(xué)效應(yīng)、作用機制以及靶基因和調(diào)控基因。

1 Bcl-6的基因結(jié)構(gòu)、分布和功能

人類原癌基因Bcl-6位于染色體3q27區(qū)域，全長26kb，含有10個外顯子和7個內(nèi)含子。相關(guān)研究表明，魚類Bcl-6基因僅含有8個外顯子，內(nèi)含子數(shù)與人類相同。Bcl-6基因編碼由706 個氨基酸組成的核磷蛋白，分子質(zhì)量大小為98ku。Bcl-6包含兩個特異性結(jié)構(gòu)：一個為N 末端的BTB／POZ（brica-bric，tramtrack，broad complex-poxvirus zine，BTB／POZ）區(qū)域，是蛋白-蛋白相互作用的基礎(chǔ)；另一個為C-末端的6 個C2-H2 鋅指結(jié)構(gòu)，是特異性DNA 結(jié)合位點。1993年，Bcl-6作為人類非霍奇金淋巴瘤（non-hodgkin＇s lymphomas，NHL）中染色體易位最頻繁基因之一首次被克隆表達［1］。

Bcl-6廣泛分布于細胞活化、分化，細胞周期調(diào)控和DNA 損傷修復(fù)等過程中，是TFH 細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子。Liou L B 等［2］研究發(fā)現(xiàn)，在同一個體的不同細胞中均有Bcl-6的分布，如表皮腫瘤細胞、嗅覺神經(jīng)元細胞、乳腺上皮細胞以及結(jié)腸細胞等，但是不同細胞中Bcl-6的表達水平存在差異，僅在生發(fā)中心（germinal center，GC）B 細胞和具有GC 表型B細胞中高表達，這也許就是不同組織中調(diào)控Bcl-6基因表達、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)存在差異最終引發(fā)腫瘤的原因。但在記憶細胞、套區(qū)細胞、邊緣區(qū)B細胞和骨髓前體B細胞中未發(fā)現(xiàn)有Bcl-6的表達。

Bcl-6的功能是抑制轉(zhuǎn)錄，進而抑制細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)Bcl-6在轉(zhuǎn)錄抑制過程中是通過與轉(zhuǎn)錄因子相互作用機制影響轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性，進而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用，即使是Bcl-6的結(jié)合位點遠離轉(zhuǎn)錄起始位點的上游或下游。例如當(dāng)Bcl-6的POZ區(qū)域與外源性DNA 結(jié)合蛋白（如GAL4）融合時就能夠有效地發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用。Lee S K 等［3］發(fā)現(xiàn)，在CD23啟動子上，Bcl-6 與干擾素調(diào)節(jié)因子4（interferon regulatory factor 4，IRF4）及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活6（signal transduction and activators of transcription 6，STAT6）相互作用形成三分子復(fù)合體，抑制CD23基因轉(zhuǎn)錄，提高了Bcl-6轉(zhuǎn)錄抑制活性，進一步闡明了Bcl-6的轉(zhuǎn)錄抑制功能。

2 Bcl-6作用機制

Bcl-6是淋巴系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)蛋白，在細胞分化中扮演著重要角色，許多作用機制涉及Bcl-6上調(diào)或下調(diào)，負反饋調(diào)節(jié)機制就是其中一個，在細胞反應(yīng)中許多轉(zhuǎn)錄抑制因子都遵循負反饋調(diào)節(jié)機制以維持新陳代謝過程中內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。眾所周知，當(dāng)B 細胞受到來自細胞因子或細胞間的多重刺激進入GC 的過程中Bcl-6表達會迅速上調(diào)，而當(dāng)移出GC 時表達會突然下調(diào)，可見，在GC B 細胞中Bcl-6的表達維持在較高水平不足為奇，也符合這一調(diào)節(jié)模式。

2.1 Bcl-6與細胞分化

Bcl-6是B淋巴細胞效應(yīng)和記憶分化的重要調(diào)節(jié)蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-6和Blimp-1（B lymphocyteinduced maturation protein-1，Blimp-1，由prdm1編碼）調(diào)節(jié)樞紐是控制B 淋巴細胞效應(yīng)和記憶分化的一個重要機制。雖然在效應(yīng)和記憶細胞命運決定調(diào)控中Bcl-6和Blimp-1無疑是最強有力的調(diào)節(jié)劑，但是Bcl-6和Blimp-1是如何在轉(zhuǎn)錄抑制水平完成調(diào)節(jié)功能的還有待研究。在研究B 細胞Bcl-6靶基因的試驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)GC B 細胞表達釋放活化誘導(dǎo)胞嘧啶脫氨酶（activation-induced cytidine deaminase，AID），誘導(dǎo)細胞凋亡和細胞周期停滯基因表達時，Bcl-6通過抑制一系列引起DNA 損傷反應(yīng)基因表達，抑制細胞凋亡。如果引起DNA 損傷反應(yīng)基因沒有被Bcl-6 所抑制，AID 誘導(dǎo)的類別轉(zhuǎn)換重組（class-switch recombi-natio，CSR）和體細胞超突變（somatic hypermutation，SHM）就會導(dǎo)致細胞凋亡和細胞周期停滯［4］。另外，Bcl-6 mRNA 豐度對于Bcl-6蛋白表達和功能是一個較弱的指示因子，在細胞分化中Bcl-6蛋白表達是受一系列轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制控制，包括mRNA 在翻譯水平的缺失，蛋白的磷酸化、乙?；舱{(diào)節(jié)因子介導(dǎo)的降解等［5］。

2.2 Bcl-6調(diào)控GC形成

GC是抗原刺激B 細胞增殖和分化的場所，由濾泡樹突狀細胞（FDCs）和濾泡B 輔助性T 細胞（TFHs）輔助完成，對細胞增殖、細胞凋亡、SHM、CSR 以及B 細胞向漿細胞或記憶細胞分化起著決定性作用，GC B 細胞和GC 源新生B 細胞有Bcl-6的高表達，Bcl-6-／-將導(dǎo)致GC 形成缺陷。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-6主要通過三種機制調(diào)控GC 的形成。①Bcl-6通過抑制P21、STAT2、TP53等細胞凋亡和細胞周期停止基因活化、誘導(dǎo)GC 經(jīng)歷SHM 和CSR。②Bcl-6通過T 細胞或在GC 形成之前的其他信號抑制未成熟B 細胞活化相關(guān)基因CD69、CD44、STAT1和CD80 表達。③Bcl-6 通過抑制Blimp-1來抑制B細胞的分化［6］。

2.3 Bcl-6調(diào)控β細胞炎性反應(yīng)和細胞凋亡

胰腺β細胞中Bcl-6的表達量很低，但可以通過無限制的活化NF-KB，促進β細胞中炎性反應(yīng)因子的表達，致使胰島炎傳播擴散、β細胞功能障礙和細胞凋亡。而胰腺β細胞中Bcl-6的過表達卻未能阻止細胞因子誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細胞凋亡。研究表明［7］，催乳素通過磷酸化作用和STAT5與Bcl-6啟動子結(jié)合來誘導(dǎo)胰島表達Bcl-6，從而抑制menin的表達，增加β 細胞的增殖。在β 細胞中，IL-1β 和IFN-γ共同作用激活NF-кB，誘導(dǎo)趨化因子／細胞因子以及促細胞凋亡信號iNOS-NO 和Fas的表達，Bcl-6的表達雖然降低了NF-кB 的活化和細胞因子誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)以及Fas和iNOS的表達及NO 的釋放，然而卻不能使β細胞免受細胞因子誘導(dǎo)的細胞凋亡，而且Bcl-6 的表達在降低了促生存蛋白A20、Bcl-2和JunB表達的同時，增加了促細胞死亡蛋白（DP）5的表達，最終Bcl-6的表達使β細胞發(fā)生細胞凋亡，這可能就是隨著時間的推移胰島移植后胰島功能漸進性降低，最后胰島素自動消失的原因之一［8］。也可能是其他一些自身免疫缺陷病共同作用的結(jié)果，在這一過程中細胞釋放ROS、NO、IL-1β、IFN-γ和TNF-α等細胞因子，加快細胞凋亡進程，有研究顯示Fas-FasL 及端粒酶B 對這一進程也起到了促進作用［9］。

3 Bcl-6作用的靶基因

對Bcl-6靶基因的鑒定主要有三種方法：①在已知基因啟動子上尋找Bcl-6結(jié)合位點，然后確定Bcl-6是否有調(diào)控此基因表達的作用；②應(yīng)用大量基因表達篩選方法，來確定Bcl-6的存在是否改變了某一基因的表達，然后再確定這一基因啟動子上是否含有Bcl-6結(jié)合位點；③猜測某一基因的表達受Bcl-6的調(diào)控，然后檢測Bcl-6對這一基因的調(diào)控以及在基因調(diào)控區(qū)域中是否含有Bcl-6結(jié)合位點。應(yīng)用以上方法，鑒定出許多Bcl-6靶基因［10］。

3.1 競爭性抑制STAT6、CD23及IgE

Bcl-6可以抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活STAT，所有STAT（STAT1-STAT6）都能夠識別一個相似的DNA 結(jié)合位點，Bcl-6就是通過與DNA 上的結(jié)合位點相結(jié)合的方式發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用，但是由于Bcl-6較STAT（主要為STAT6）在DNA 結(jié)合親和性上存在一定的限制性，因此只能通過STAT 識別位點抑制一小部分基因的轉(zhuǎn)錄。CD23編碼一個低親和性的IgE受體，是最早被鑒定出來的Bcl-6 靶基因之一。在人類CD23基因啟動子上含有Bcl-6結(jié)合位點，但在小鼠的相關(guān)試驗中沒有發(fā)現(xiàn)Bcl-6的結(jié)合位點，因此Bcl-6 只能抑制人類CD23 基因轉(zhuǎn)錄。在CD23基因啟動子上的DAN 結(jié)合位點也是STAT6的作用靶位，當(dāng)STAT6處于激活狀態(tài)時，Bcl-6能夠抑制IL-4-STAT6誘導(dǎo)的CD23轉(zhuǎn)錄［11］。

3.2 抑制CD69、CD44和Blimp-1

CD69和CD44是B細胞活化相關(guān)基因，在B細胞活化過程中表達上調(diào)，而Blimp-1是B 細胞分化相關(guān)基因，在B細胞向漿細胞的終極分化過程中表達上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)CD69基因含有Bcl-6結(jié)合位點，雖然這個位點功能的重要性還未完全闡明，而在CD44和Blimp-1 基因上還沒有發(fā)現(xiàn)Bcl-6 結(jié)合位點，但Bcl-6卻能夠抑制CD44和Blimp-1基因的表達，關(guān)于Bcl-6抑制CD44和Blimp-1表達的機制還不十分清楚［12］，充分說明Bcl-6作用機制具有復(fù)雜性。

3.3 p27kip1和CyclinD2

p27kip1 是細胞周期依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）抑制物，能夠使細胞周期停滯在某一分裂期而終止有絲分裂。研究人員在p27kip1基因序列上未發(fā)現(xiàn)有Bcl-6 結(jié)合位點，但Sharma G 等［13］研究表明，在Bcl-6陽性Raji B細胞性淋巴瘤細胞培養(yǎng)液中加入Bcl-6活性抑制劑，腫瘤細胞生長明顯減慢，而且隨著細胞凋亡數(shù)的增加p27kip1 表達也上調(diào)，這就說明Bcl-6 能夠抑制p27kip1表達。CyclinD2也是Bcl-6作用的靶基因，GC B細胞中CyclinD2表達缺乏與GC B細胞中Bcl-6高表達相一致，而且在CyclinD2 啟動子上發(fā)現(xiàn)了高親和性Bcl-6結(jié)合位點。細胞周期蛋白共有CyclinD1、CyclinD2和CyclinD3三種，而Bcl-6僅抑制CyclinD2表達的原因還不是很清楚，可能在細胞分裂周期中CyclinD2的作用效果較弱。

4 Bcl-6表達調(diào)控

在細胞分化、活化，GC 的形成以及炎性反應(yīng)和抗體分泌過程中Bcl-6的表達受多種基因及細胞因子的調(diào)節(jié)，充分反映了調(diào)節(jié)機制的復(fù)雜性。

4.1 Blimp-1抑制Bcl-6表達

Blimp-1由prdm1編碼，是一種轉(zhuǎn)錄抑制蛋白，在誘導(dǎo)B細胞向抗體分泌型漿細胞的終極分化中發(fā)揮重要作用。Blimp-1和Bcl-6是一對拮抗物，在細胞分化中通過彼此抑制完成相應(yīng)細胞的分化。例如在GC B細胞分化時，Bcl-6與prdm1相結(jié)合直接抑制Blimp-1的表達，誘導(dǎo)GC B 細胞分化，抑制漿細胞分化；相反，在漿細胞的分化過程中Blimp-1 與Bcl-6相結(jié)合抑制Bcl-6的表達，同時調(diào)控與漿細胞分化有關(guān)的其他基因表達，最終完成漿細胞分化。研究表明［12］，在人體內(nèi)Blimp-1 是通過干涉AP-1位點抑制人類Bcl-6mRNA 及蛋白的表達，但在小鼠試驗中，Blimp-1可能是以另外一種機制抑制Bcl-6的表達［14］。

4.2 IL-21促進Bcl-6的表達

IL-21直接作用于B 細胞，使B 細胞最大化地表達Bcl-6以促進GC B 細胞生長發(fā)育。未成熟T細胞中，IL-21上調(diào)Bcl-6的表達，充分解釋了IL-21信號缺乏時，TFH 細胞形成缺陷和GC B 細胞數(shù)量減少的現(xiàn)象［15］。Bcl-6對于GC反應(yīng)是十分重要的，IL-21誘導(dǎo)T 細胞中Bcl-6的表達，也利于誘導(dǎo)GC B細胞形成過程中Bcl-6 的表達。另外［16］，在研究IL-21作為生物佐劑抑制HIV DNA 疫苗引起的體液免疫試驗中發(fā)現(xiàn)，IL-21通過減少漿細胞數(shù)增加了Bcl-6蛋白表達量，增強了以HIV 外膜蛋白為主要成分的DNA 疫苗引起的細胞免疫，提高抗原特異性細胞毒性反應(yīng)，抑制了體液免疫。CD8＋T 細胞中IFN-γ的表達也說明IL-21通過與IL-21受體結(jié)合，誘導(dǎo)JAK1和JAK3酪氨酸磷酸化作用，刺激IFN-γ表達上調(diào)，增強細胞毒性反應(yīng)。IL-6，Rac1 信號，TGF-β和Hsp90等細胞因子和細胞表達信號也調(diào)控Bcl-6的表達［17］，但作用機制尚不清楚。

5 結(jié)語

Bcl-6的生物學(xué)活動是一個復(fù)雜的多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，在轉(zhuǎn)錄抑制中的調(diào)節(jié)機制也充滿復(fù)雜性。目前雖然已對Bcl-6的作用機制和基因的表達調(diào)控有了充分的了解，但是仍有許多疑點尚不清楚，尤其是蛋白乙?；瘜cl-6作用的影響和細胞信號途徑對Bcl-6功能的調(diào)控，還有Bcl-6 在T 細胞中的作用、調(diào)控路徑等，因此，進一步闡明Bcl-6與細胞的內(nèi)在關(guān)聯(lián)和細胞內(nèi)在信號通路的調(diào)控機制，對充分揭示Bcl-6表達調(diào)控具有重要意義。

［1］Mahmoud H M，El-Sakhawy Y N.Significance of Bcl-2and Bcl-6immunostaining in B-Non Hodgkin＇s lymphoma［J］.Hematol Rep，2011，26（3）：80-85.

［2］Liou L B，Wu M W，Cha W J.Macrophages and abnormal BCL-6or c-MYC gene expression affect the resistance of peritoneal B cells to induction of hyporesponsiveness［J］.Scand J Immunol，2009，69（5）：447-456.

［3］Lee S K，Rigby R J，Zotos D，et al.B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6expression by T cells［J］.J Exp Med，2011，208（21）：1377-1388.

［4］Crotty S，Johnston R J，Schoenberger S P.Effectors and memories：Bcl-6and Blimp-1in T and B lymphocyte differentiation［J］.Nat Immunol，2010，11（2）：114-120.

［5］Johnston R J，Poholek A C，Toro D D，et al.Bcl6and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation［J］.Science，2009，32（5）：1006-1010.

［6］Oestreich K J，Mohn S E，Weinmann A S.Molecular mechanisms that control the expression and activity of Bcl-6in TH1 cells to regulate flexibility with a TFH-like gene profile［J］.Nature Immunol，2012，13（4）：405-412.

［7］Pinto A E，Andre S，Silva G，et al.BCL-6oncoprotein in breast cancer：loss of expression in disease progression［J］.Pathobiol，2009，76（5）：235-242.

［8］Esteve M I，Gurzov E N，Eizirik D L，et al.The transcription factor B-cell lymphoma（BCL）-6modulates pancreaticβ-cell inflammatory responses［J］.Endocrinology，2011，15（2）：447-456.

［9］Ohtani M，Miyadai T，Hiroishi S.Molecular cloning of the BCL-6gene，a transcriptional repressor for B-cell differentiation，in torafugu （Takifugu rubripes）［J］.Mol Immunol，2006，43（7）：1047-1053.

［10］Shao Y，Kim S Y，Shin D，et al.TXNIP regulates germinal center generation by suppressing BCL-6expression［J］.Immunol Lett，2010，129（2）：78-84.

［11］Borthakur S，Hibbert R G，Pang M O Y，et al.Protein structure and folding：Mapping of the CD23binding site on immunoglobulin E（IgE）and allosteric control of the IgE-FcRI interaction［J］.J Biol Chem，2012，287（37）：31457-31461.

［12］Vazquez B N，Laguna T，Carabana J，et al.Molecular and structure immunology：CD69gene is differentially regulated in T and B cells by evolutionarily conserved promoter-distal elements［J］.J Immuno，2009，183（10）：6513-6521.

［13］Sharma G，Mirza S，Prasad C P，et al.Promoter hypermethylation of p16INK4A，p14ARF，CyclinD2and Slit2in serum and tumor DNA from breast cancer patients［J］.Life Sci，2007，80（20）：1873-1881.

［14］Tunyaplin C，Shaffer A L，Angelin-Duclos C D，et al.Direct repression of prdm1by Bcl-6inhibits plasmacytic differentiation［J］.J Immunology，2004，17（3）：1158-1165.

［15］Linterman M，Beaton L，Yu D，et al.IL-21acts directly on B cells to regulate Bcl-6expression and germinal center responses［J］.J Exp Med，2010，20（7）：353-363.

［16］Feng C，Jin J，Zou Q，et al.Interleukin-21inhibits humoral response to an HIV DNA vaccine by enhancing Bcl-6and Pax-5expression［J］.Viral Immunol，2012，25（2）：131-140.

［17］Cerchietti L C，Lopes E C，Yang S N，et al.A purine scaffold Hsp90inhibitor destabilizes BCL-6and has specific antitumor activity in BCL-6-dependent B cell lymphomas［J］.Nat Med，2009，15（12）：1369-1376.