精蛋白異常研究進(jìn)展

孫子龍，牛瑞燕，邊升太，王志強(qiáng)，張建海，王金明，王俊東＊

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 生態(tài)畜牧與環(huán)境獸醫(yī)學(xué)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太谷030801；2.大同市新榮區(qū)薪源種羊場(chǎng)，山西大同037002）

精子中的精蛋白和DNA 從被發(fā)現(xiàn)并分離出來(lái)到現(xiàn)在已經(jīng)有100多年的歷史。在精子細(xì)胞階段，核內(nèi)堿性蛋白質(zhì)經(jīng)歷了由組蛋白（histones，H1，H2A，H2B，H3 和H4）-過(guò)渡蛋白（transition proteins，TPs，如TP1，TP2，TP3等）-精蛋白（protamine，P）的轉(zhuǎn)換過(guò)程，這個(gè)過(guò)程稱為組蛋白-精蛋白取代反應(yīng)（histone-to-protamine replacement reaction，HPRR），人類大約有85%的組蛋白被精蛋白替代，通過(guò)HPRR，精子細(xì)胞核由圓形變?yōu)殚L(zhǎng)形，核高度濃縮，形成長(zhǎng)形精子細(xì)胞，進(jìn)入附睪后進(jìn)一步成熟，形成成熟的精子。精蛋白異常就會(huì)干擾HPRR，進(jìn)而影響精子的正常發(fā)生、發(fā)育，造成異常染色質(zhì)形成，使精子的受精能力喪失或下降，最終導(dǎo)致不育［1-2］。

1 精蛋白概述

精蛋白又稱魚精蛋白，分子質(zhì)量約為4ku～7 ku，是在晚期精子細(xì)胞中出現(xiàn)的一類富含精氨酸和半胱氨酸的堿性蛋白質(zhì)，帶有大量的正電荷，與帶有負(fù)電荷的父本DNA 緊密結(jié)合形成濃縮的染色質(zhì)。另外，蛋白分子內(nèi)及分子間通過(guò)半胱氨酸形成二硫鍵，使得精子細(xì)胞由圓形變?yōu)殚L(zhǎng)形，染色質(zhì)包裹的更加緊密。精子基因在這種精子特有堿性蛋白保護(hù)下處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，從而暫時(shí)失去DNA 的轉(zhuǎn)錄與RNA 的合成，而這也正是成熟精子的特征［3-4］。

已知在哺乳動(dòng)物有兩種類型的精蛋白，即P1和P2家族，P1 存在于所有的哺乳動(dòng)物，P2 家族包括P2、P3、P4，它們僅存在于某些哺乳動(dòng)物，如人類、小鼠等。P1和P2家族的基因位于16號(hào)染色體上，P1可以直接合成成熟的蛋白質(zhì)，而P2家族成員需要先合成P2前體，經(jīng)過(guò)N 端的加工形成不同的家族成員。有證據(jù)表明精蛋白最初來(lái)源于組蛋白H1［2，5-6］。

目前認(rèn)為精蛋白可對(duì)精子染色質(zhì)的凝聚、精子遺傳信息的保護(hù)及受精后胚胎的正常發(fā)育有重要作用：①精蛋白對(duì)父本基本組的包裹使得精子的形狀更符合流體力學(xué)，游動(dòng)速度更快，受精時(shí)間縮短；②精子染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型不同于一般體細(xì)胞染色質(zhì)中核小體串珠狀排列的結(jié)構(gòu)模型，較后者濃縮了6倍，使精子染色質(zhì)高度濃縮、結(jié)構(gòu)高度穩(wěn)定，對(duì)內(nèi)外環(huán)境中的核酸酶和各種誘變劑及機(jī)械損傷的抵抗能力大大提高；③致密包裹的成熟精子轉(zhuǎn)錄不活潑，這種轉(zhuǎn)錄惰性能使父本的遺傳信息完整且無(wú)干擾的傳給下一代。因此，在受精過(guò)程中，由于精蛋白的異常引起精子核不能正常解聚，進(jìn)一步影響雄原核的形成及其與雌原核的融合；如果精蛋白異常導(dǎo)致精子源性組蛋白再次被包裝入受精卵染色質(zhì)中，妨礙卵裂時(shí)染色體的行為及胚胎發(fā)育過(guò)程中基因的表達(dá)與調(diào)控，使胚胎發(fā)育異常，從而間接地影響了受精及胚胎發(fā)育［7］。

2 精蛋白異常與不育的關(guān)系

1976 年，Sliverstroni等報(bào)道了少精子癥不育患者的成熟精子缺乏精蛋白成分，提出這是由于精蛋白異?；蛉笔С霈F(xiàn)了精核蛋白轉(zhuǎn)型障礙所導(dǎo)致的，從而首次提出精蛋白與不育的關(guān)系。Balhorn 等通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)正常人的P1／P2 為0.98±0.12（n＝17），而不育病人的P1／P2為1.58±0.24（n＝7），此后，大量的研究報(bào)道相繼證明了不育樣本與正常樣本相比含有更少的精蛋白，更多的組蛋白和過(guò)渡蛋白。在不育病人中，甚至存在P2 的缺失，de Yebra等發(fā)現(xiàn)不育病人的3.4%無(wú)法檢測(cè)出P2的含量（n＝4），Carrell等發(fā)現(xiàn)17%（13／75）的不育患者檢測(cè)不到P2，與能檢測(cè)到P2的患者相比，其中12名病患的精子穿透能力下降。而且，在不育患者接受治療后精蛋白的含量還會(huì)發(fā)生變化［7］。

關(guān)于P1／P2的比值，Aoki V W等［8］給出了較細(xì)致的研究結(jié)果，正常樣本（n＝87）中P1／P2 為1.06±0.01；在不育樣本中，P1／P2＜0.8 占 到13.6%（n＝37），0.8＜P1／P2＜1.2 有46.7%（n＝127），P1／P2＞1.2 有39.7%（n＝108）病人不育。雖然P1和P2mRNA 含量與其蛋白含量有相關(guān)性，然而研究發(fā)現(xiàn)正常樣本（n＝10）中P1 mRNA／P2 mRNA 為1∶1.7，不育樣本（n＝95）的P1mRNA／P2mRNA 為1∶1，與P1／P2 蛋白的比值稍有不同［9］。而Nanassy L等［10］報(bào)道正常人群精液中P1／P2比值的范圍應(yīng)該是0.54～1.43，這說(shuō)明關(guān)于P1／P2與不育的確切關(guān)系還需進(jìn)一步的研究。

除此之外，Khara K K 等［11］將P1／P2的比值與卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）受精率聯(lián)系起來(lái)，發(fā)現(xiàn)在不育病人中，當(dāng)0.55＜P1／P2＜1.29，ICSI受精率≥50%（n＝18），當(dāng)P1／P2＜0.55或＞1.29，ICSI受精率＜50%（n＝3）。Aoki V W 等［12］發(fā)現(xiàn)精子的穿透能力和受精率在P1／P2 比值異常的患者中顯著降低，Depa-Martynow M 等［13］通過(guò) 對(duì)92 名患者進(jìn)行調(diào)查，P1／P2（mRNA 和蛋白）與IVF 受精率、A級(jí)胚胎質(zhì)量呈顯著正相關(guān)。且有報(bào)道指出P2前體／P2、P1／P2的比值與妊娠率明顯相關(guān)［14］。

目前認(rèn)為精蛋白異常可影響精子染色質(zhì)的正常凝聚和穩(wěn)定性，易致DNA 損傷，引起細(xì)胞凋亡，并造成精子頭部形態(tài)異常，形成畸形精子，使精子受精能力下降［4，9，13，15］。

3 精蛋白異常的原因

精核蛋白基因表達(dá)的調(diào)控環(huán)節(jié)多而復(fù)雜，如DNA 水平、轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平、翻譯后加工等環(huán)節(jié)。這些環(huán)節(jié)的調(diào)控序列大多位于旁側(cè)序列中，即使基因編碼區(qū)結(jié)構(gòu)正常，而旁側(cè)調(diào)控序列存在異常，亦可在上述環(huán)節(jié)影響精核蛋白的正常合成，導(dǎo)致精核蛋白的穩(wěn)定性及其與DNA 的親和力降低。

3.1 基因多態(tài)性

精蛋白的基因突變或多態(tài)性能夠?qū)е碌鞍椎臉?gòu)象發(fā)生變化，從而影響與DNA 的結(jié)合。Tanaka H等［16］報(bào)道P1的4個(gè)同義單核苷酸多態(tài)性（SNPs）和P2的1個(gè)SNP產(chǎn)生了終止密碼子，P2的翻譯終止使P2含量減少，引起不育。Iguchi N 等［17］在10%（3／30）的病人中發(fā)現(xiàn)SNP 改變了保守的精氨酸殘基，將其變?yōu)榻z氨酸，從而影響正常的精蛋白磷酸化。Aoki V W 等［18］對(duì)精蛋白異常的病人做了SNP檢查，發(fā)現(xiàn)15處SNPs，其中P1有3個(gè)SNPs，P2有7個(gè)，TP1有2個(gè)，TP2有3 個(gè)，而且這些變化中包含了Tanaka的SNPs，但變化的頻率在對(duì)照組中同樣存在。以上研究表明基因多態(tài)性并非引起精蛋白異常的普遍原因。除了研究編碼區(qū)的基因序列，上、下游的非編碼區(qū)的突變也得到了學(xué)者的重視。de Jonckheere J等［19］于P2轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的上游GA 重復(fù)區(qū)發(fā)現(xiàn)了基因突變。Hammoud S等［20］在P1、P2的非編碼區(qū)識(shí)別了14處SNPs。精蛋白基因的表達(dá)是一個(gè)復(fù)雜的多因子調(diào)控的結(jié)果，闡明精蛋白表達(dá)與精蛋白基因突變之間的關(guān)系，還有待于對(duì)該基因更多位點(diǎn)的進(jìn)一步研究。

3.2 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)

精蛋白轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)與核基質(zhì)結(jié)合區(qū)（nuclear matrix attachment regions，MARs）和啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子密切相關(guān)。MARs是與核基質(zhì)（或核骨架）特異結(jié)合的DNA 序列，精蛋白基因的5′端和3′端都含有MARs，它們是DNA 與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的順式作用元件，有研究表明當(dāng)只存在3′-MAR 而5′-MAR 缺失時(shí)，會(huì)使精蛋白轉(zhuǎn)錄受到抑制，這是因?yàn)?′-MAR有防止精蛋白基因沉默的作用，只有上、下游的MAR 協(xié)同配合才會(huì)使精蛋白基因正確的轉(zhuǎn)錄［21］。

啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子包括TATA-box 蛋白（TATA-box protein，TBP），cAMP 應(yīng)答調(diào)節(jié)元件（cAMP response element modulator，CREM）和Y-box蛋白。TBP的重要性體現(xiàn)在精蛋白基因轉(zhuǎn)錄起始階段，因?yàn)樗梢越Y(jié)合TATA 序列，有利于RNA聚合酶2發(fā)揮作用。TBP在小鼠18日齡～28日齡過(guò)表達(dá)，這與單倍體細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄是一致的［22］。類TBP因子（TBP-like factor，TLF）是一種與TBP序列相似專門結(jié)合TATA-less啟動(dòng)子的蛋白質(zhì)，早期粗線期階段存在于胞質(zhì)中，然后進(jìn)入核內(nèi)持續(xù)至圓形精子時(shí)期，在長(zhǎng)形精子時(shí)期返回胞質(zhì)中，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，TLF 可以作為激活物和阻遏物起作用，TLF 缺乏的小鼠出現(xiàn)異常的染色質(zhì)，從而影響HPRR 過(guò)程［23］。

轉(zhuǎn)錄因子CREM 在雄性生殖細(xì)胞中高表達(dá)，它調(diào)控著一些減數(shù)分裂后基因的轉(zhuǎn)錄，如過(guò)渡蛋白和精蛋白。研究表明CREM 靶基因敲除的雄性小鼠在圓形精子時(shí)期就阻止了細(xì)胞進(jìn)一步成熟，導(dǎo)致小鼠不育［24］。

Y-box蛋白是一類重要的精子發(fā)生調(diào)節(jié)蛋白，它們能夠結(jié)合DNA 和RNA，一般上調(diào)轉(zhuǎn)錄下調(diào)翻譯。在人類和小鼠的生殖細(xì)胞中已經(jīng)鑒定了一些Y-box蛋白，其中Contrin和它的小鼠直系同源基因MSY2被認(rèn)為與精蛋白的表達(dá)有關(guān)。作為精蛋白基因的轉(zhuǎn)錄激活物，Contrin／MSY2可以結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列，Yang J等［25］用MSY2基因敲除的小鼠模型來(lái)研究MSY2的功能，發(fā)現(xiàn)了嚴(yán)重的無(wú)定型和多核精子細(xì)胞。

3.3 翻譯水平的調(diào)節(jié)

精蛋白基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在圓形精子細(xì)胞時(shí)期，隨后mRNAs被存儲(chǔ)在翻譯抑制的核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）中，在長(zhǎng)形精子細(xì)胞時(shí)期激活開(kāi)始進(jìn)行翻譯。在這一時(shí)期，連續(xù)的核蛋白取代和精子細(xì)胞成功分化為成熟精子就顯得至關(guān)重要。延遲的mRNA 翻譯阻止了新的mRNA 的合成，避免了過(guò)早的染色質(zhì)濃縮。

雖然精蛋白翻譯水平的調(diào)節(jié)不是十分清楚，但是3′端非編碼區(qū)的調(diào)節(jié)位點(diǎn)已經(jīng)被識(shí)別。Y-box蛋白Contrin和Translin、驅(qū)動(dòng)蛋白KIF 17B對(duì)延遲翻譯階段RNP轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中有著重要的調(diào)節(jié)作用。PolyA 結(jié)合蛋白在精蛋白翻譯水平調(diào)節(jié)方面有兩個(gè)重要作用，一是防止mRNA 降解，保護(hù)翻譯前的mRNA；二是作為阻遏物參與翻譯調(diào)節(jié)。P1RNA結(jié)合蛋白（protamine 1 RNA-binding protein，PRBP）在分化的雄性生殖細(xì)胞中高表達(dá)，結(jié)合部位在3′端非編碼區(qū)，PRBP 缺失的雄性小鼠由于精蛋白翻譯失敗，影響了HPRR，最終導(dǎo)致少精和不育［7，26］。

3.4 翻譯后加工的調(diào)節(jié)

精蛋白翻譯后被快速磷酸化，P1 被剪接因子SR——蛋白特異的激酶1（SRPK1）磷酸化，P2前體被Camk4磷酸化，而后水解成成熟的P2?？梢?jiàn)SRPK1和Camk4的突變成為精蛋白異常表達(dá)的潛在因素之一。已有報(bào)道證實(shí)Camk4的靶點(diǎn)突變會(huì)引起P2的喪失和TP2的截留，導(dǎo)致雄鼠不育［27］。Yoshii T 等［28］運(yùn)用2D技術(shù)鑒別了P1的5個(gè)變異體，P2的6個(gè)變異體，這表明2D 技術(shù)將有助于精蛋白翻譯后加工情況的研究。

4 結(jié)語(yǔ)

大量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)已經(jīng)證實(shí)精蛋白異常會(huì)降低雄性動(dòng)物的生育力，但具體的機(jī)理仍有待進(jìn)一步研究，如精蛋白異常所涉及的基因和蛋白還有哪些，他們是如何其作用的；精蛋白、過(guò)渡蛋白的基因突變和多態(tài)性到底在多大程度上調(diào)控著精蛋白的表達(dá)；以及精蛋白異常、DNA 損傷、精子表觀遺傳學(xué)的變化、生育力下降之間的關(guān)系到底是怎樣的；還有沒(méi)有精蛋白異常引起不育的其他通路等等。相信這些問(wèn)題的解決有助于人們更深入地理解精蛋白的功能和不育之間的關(guān)系。

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