大腸埃希菌外膜蛋白F 與細(xì)菌耐藥性研究進(jìn)展

崔艷艷，高 洪，嚴(yán)玉霖，趙 汝，盧 琴，李祥峰，邵志勇，臧雅婷

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201）

大腸埃希菌血清型眾多，地域性較強(qiáng)，耐藥性突出，感染率較高，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)的發(fā)展。目前，對(duì)于大腸桿菌病的防治主要是使用抗生素和疫苗，而大腸埃希菌耐藥性的產(chǎn)生給其防治帶來嚴(yán)峻的考驗(yàn)，同時(shí)藥物殘留又影響豬肉及其他畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量，嚴(yán)重威脅人類健康。因此，大腸埃希菌耐藥性受到高度重視，已成為世界范圍內(nèi)普遍關(guān)注的問題。

目前，大腸埃希菌耐藥機(jī)制研究主要集中在外膜通透性改變，形成相應(yīng)的水解酶，泵系統(tǒng)外排，作用靶位改變，外膜滲透壓的減小以及形成生物被膜等。近年來已有研究證實(shí)OmpF可以引起耐藥性，但是這種耐藥機(jī)制的形成目前尚不是很清楚。本文就OmpF結(jié)構(gòu)、調(diào)控系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄因子等引起的耐藥性進(jìn)行以下探討。

1 大腸埃希菌耐藥現(xiàn)狀

大腸桿菌病發(fā)病率在畜禽細(xì)菌性疾病中居第一，大腸埃希菌對(duì)各種抗生素如β－內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氯霉素、氨基糖苷類、親水的氟喹諾酮類等出現(xiàn)嚴(yán)重的多重耐藥性，導(dǎo)致嚴(yán)重感染后出現(xiàn)致死病例。目前，對(duì)于大腸埃希菌耐藥機(jī)制研究可知其耐藥機(jī)制主要表現(xiàn)在抗菌藥物作用位點(diǎn)的改變或新作用位點(diǎn)的產(chǎn)生，酶對(duì)抗菌藥物的修飾或破壞，減少抗菌藥物向菌體內(nèi)的攝入，增加抗菌藥物從菌體向細(xì)胞外的主動(dòng)外排作用。研究表明大腸埃希菌外膜蛋白可以通過改變外膜通透性來影響耐藥性，在耐藥過程中起重要作用。大腸埃希菌外膜蛋白缺失和突變對(duì)銀納米抗菌劑抵抗力比野生菌株提高4倍～8倍［1］。有研究［2］構(gòu)建了雙重突變型（OmpC，OmpF缺失）菌株，證明了OmpF的丟失是大腸埃希菌對(duì)β－內(nèi)酰胺類抗生素和氟喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性的原因之一。瑞普公司研發(fā)中心藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，近幾年在臨床上常用抗菌藥物中80%已對(duì)大腸埃希菌產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性，處于被淘汰的境地。所以，大腸埃希菌的耐藥性問題是一個(gè)亟待解決的問題。

2 外膜蛋白與抗生素的耐藥性

在正常生理?xiàng)l件下，大腸埃希菌外膜通道不僅對(duì)于環(huán)境中的pH有敏感性的功能，還對(duì)于環(huán)境中的滲透壓有調(diào)節(jié)功能。大腸埃希菌細(xì)胞外膜上的某些特殊外膜蛋白，如OmpF是一種外膜孔道蛋白（porin），也是一種非特異性的、跨越細(xì)胞膜的水溶性擴(kuò)散通道。大腸埃希菌的外膜孔道蛋白是某些抗生素進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮殺菌作用的必經(jīng)之路，所以大腸埃希菌外膜蛋白的結(jié)構(gòu)及調(diào)控孔道蛋白表達(dá)因素的改變都會(huì)引起耐藥性。

2.1 OmpF結(jié)構(gòu)及與耐藥性的關(guān)系

抗菌藥物只有跨膜進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)到達(dá)靶位才能發(fā)揮殺菌作用，革蘭陰性菌獨(dú)特的外膜結(jié)構(gòu)，可以抵抗宿主防御因子及許多有效抗生素，這是因?yàn)樘厥獾慕Y(jié)構(gòu)可對(duì)物質(zhì)的大小、電荷、空間位置都有選擇性，而膜孔蛋白構(gòu)成的通道就是決定這種選擇性的關(guān)鍵。

大腸埃希菌外膜孔道蛋白OmpF是大腸埃希菌外膜蛋白中的兩個(gè)親水性的非特異性孔道蛋白（porin）之一。有研究用X射線晶體照相技術(shù)探明膜孔蛋白（porin）ompf為β－折疊三聚體結(jié)構(gòu)，有較寬的開口和出口，中間為較窄的限制部分，合成是由OmpB3基因控制的，而調(diào)節(jié)基因OmpB由OmpR和EnvZ兩個(gè)基因所組成［3］。Bredin J等［4］研究發(fā)現(xiàn)，外膜孔道蛋白OmpF中L3環(huán)暴露在細(xì)胞表面，折疊在β－桶內(nèi)部，形成類似環(huán)面的狹窄的區(qū)帶。L3環(huán)的這種特殊結(jié)構(gòu)決定OmpF孔蛋白的離子通道大小，及靜電學(xué)特征。還有研究［5］發(fā)現(xiàn)OmpFL3環(huán)中酸性氨基酸D113和E117對(duì)于OmpF蛋白的離子電導(dǎo)、離子選擇起重要作用。這些特殊的結(jié)構(gòu)都與大腸埃希菌素A、精氨酸和抗生素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)有直接的關(guān)系。許多疏水性抗生素大多經(jīng)過OmpF通道，所以大多耐疏水性的抗生素如β－內(nèi)酰胺類抗生素的菌株的孔蛋白 OmpF缺失［6］。研究發(fā)現(xiàn)［7］，在細(xì)胞內(nèi)OmpF結(jié)合位點(diǎn)中心D113位點(diǎn)處，Mg2＋對(duì)于天冬氨酸有很高的結(jié)合性。所以在Mg2＋參與下能夠改變電荷，并能使恩諾沙星通過孔腔內(nèi)具有第一羧基可變區(qū)狹窄的限制部分進(jìn)入細(xì)胞。

2.2 OmpF生理功能與耐藥性關(guān)系

外膜蛋白F的這種特殊的結(jié)構(gòu)影響著其生理功能，這種生理功能與孔蛋白引起的耐藥性有著直接的關(guān)系。外膜蛋白本身有調(diào)節(jié)外膜通透性的功能［8－9］，帶有不同電荷分子進(jìn)出細(xì)胞是通過外膜蛋白F的擴(kuò)散，三聚體結(jié)構(gòu)間的相互作用是通過脂質(zhì)間相互作用介導(dǎo)的，而不是蛋白質(zhì)間的作用，其中有序的脂質(zhì)鏈存在于接近孔蛋白表面帶正荷的區(qū)域，這些正電荷區(qū)域可以形成電場(chǎng)對(duì)進(jìn)入孔道內(nèi)的離子進(jìn)行偏轉(zhuǎn)，阻礙某些抗生素進(jìn)入細(xì)胞［10］。外膜蛋白通過電場(chǎng)的偏轉(zhuǎn)與孔道蛋白本身的阻塞阻止抗生素進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，是兩個(gè)不同的機(jī)制。有研究［11］用分子動(dòng)力學(xué)模擬表明在孔蛋白孔腔內(nèi)較窄的限制部分存在橫向靜電場(chǎng)的偏轉(zhuǎn)，這個(gè)電場(chǎng)可以降低頭孢噻肟通過孔道。外膜蛋白F孔道的孔腔內(nèi)溶劑有很高的親和力，可以加快抗生素流入細(xì)胞內(nèi)速度，并伴隨有水溶性蛋白質(zhì)氫鍵的生成，孔道內(nèi)不能溶解的抗生素的快速流出是因?yàn)榈鞍卓變?nèi)溶劑的缺失［12］。還有研究證實(shí)［13］OmpF本身是一種選擇性的運(yùn)輸?shù)鞍?，不僅運(yùn)輸離子和蛋白質(zhì)毒素進(jìn)出細(xì)胞，還可以運(yùn)輸YebF蛋白家族進(jìn)出細(xì)胞。在酸性條件下，通過OmpF通道對(duì)精氨酸、賴氨酸和它們的脫羧基產(chǎn)物的運(yùn)輸對(duì)于大腸埃希菌的生存也是必不可少的。由以上可知，孔道蛋白特殊的生理功能，腔內(nèi)特殊的電場(chǎng)和腔內(nèi)溶劑的存在及孔道蛋白本身的選擇性的運(yùn)輸功能，都與耐藥性有直接的關(guān)系。

2.3 OmpF二元調(diào)控系統(tǒng)與耐藥性的關(guān)系

戎建榮等［14］證明大腸埃希菌連續(xù)使用抗生素將導(dǎo)致OmpF低表達(dá)或者不表達(dá)，使細(xì)胞膜通透性降低，即增加細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性。而二元調(diào)控系統(tǒng)EnvZ／OmpR和CpxA／CpxR的調(diào)控可以精細(xì)調(diào)控OmpF的表達(dá)變化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞通透性以適應(yīng)不同的環(huán)境，其中包括抗生素環(huán)境［15］。EnvZ或CpxA編碼的蛋白是外膜上的一種受體蛋白，它先感受環(huán)境中滲透壓的變化，再將此信息傳遞給細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白OmpR或CpxR蛋白。這兩個(gè)雙組分調(diào)控系統(tǒng)機(jī)制相似，EnvZ或CpxA感受環(huán)境變化，EnvZ或CpxA發(fā)生磷酸化，再將信號(hào)（磷酸基團(tuán)）傳遞給OmpR或CpxR，OmpR或CpxR然后調(diào)節(jié)OmpF孔蛋白表達(dá)降低，OmpF在外膜上形成通道減少，從而導(dǎo)致通透性降低，形成耐藥?？椎赖鞍譕mpF形成的通道可以使小分子質(zhì)量親水性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。許多抗生素都是經(jīng)過此通道進(jìn)入細(xì)胞達(dá)到作用靶位，發(fā)揮殺菌作用的。顯然，EnvZ／OmpR和CpxA／CpxR二元調(diào)控系統(tǒng)在大腸埃希菌耐藥中起著重要的作用。

2.4 OmpF的轉(zhuǎn)錄因子SoxR與耐藥性關(guān)系

有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)甲基紫精誘導(dǎo)后的大腸埃希菌，對(duì)許多抗生素的抗性表現(xiàn)出一定程度的增強(qiáng)［16］。有人認(rèn)為這種抗性的普遍增強(qiáng)與SoxR激活micF的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子SoxR是典型的汞抗性操縱子調(diào)節(jié)因子家族的成員，感受胞內(nèi)氧化還原電勢(shì)，通過鐵硫簇失去一個(gè)電子，而激活目標(biāo)基因的表達(dá)。micF是反義RNA，與大腸埃希菌外膜蛋白基因OmpF同源性極高。轉(zhuǎn)錄因子SoxR錯(cuò)把micF當(dāng)成大腸埃希菌外膜蛋白F的mRNA進(jìn)行激活，而大腸埃希菌外膜蛋白F的mRNA發(fā)生轉(zhuǎn)錄后基因沉默，而使OmpF合成減少，細(xì)胞通透性降低［17］，從而阻止抗生素進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮殺菌作用。另外，有研究［18］構(gòu)建 OmpR、EnvZ、CpxA和CpxR基因缺失菌株并用萘啶酮酸、金霉素來研究OmpC和OmpF和二元調(diào)控系統(tǒng)（TCSs）的關(guān)系，結(jié)論是ATP上調(diào)與下調(diào)同時(shí)伴隨OmpF對(duì)濫用金霉素和萘啶酮酸相應(yīng)的低表達(dá)和高表達(dá)。ATP的變化是受CpxR調(diào)控的，而OmpC與OmpF孔蛋白合成與通透性改變時(shí)都需要能量ATP供應(yīng)，因此轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄，二元調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)控與耐藥性都是有直接關(guān)系的，它們的改變都可以影響到外膜孔蛋白的變化，影響細(xì)菌外膜通透性，從而影響大腸埃希菌的耐藥性。

3 小結(jié)與展望

近年來，大腸埃希菌耐藥性受到研究者的高度重視，耐藥性的產(chǎn)生不僅給大腸埃希菌病防治帶來嚴(yán)峻的考驗(yàn)，也給畜牧業(yè)的生產(chǎn)和醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)帶來了嚴(yán)重的危害。通過對(duì)大腸埃希菌外膜蛋白F引起耐藥水平提高的研究可知，OmpF表達(dá)降低或者OmpF缺失可使菌體外膜通透性降低，從而阻礙抗生素進(jìn)入細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。因此，可以從改變外膜蛋白F結(jié)構(gòu)，調(diào)控系統(tǒng)，轉(zhuǎn)錄因子等方面與耐藥性關(guān)系入手，改變外膜蛋白F組成與數(shù)量、調(diào)控系統(tǒng)及轉(zhuǎn)錄因子等開發(fā)膜通透劑，破壞外膜滲透屏障，使大部分抗生素順利進(jìn)入細(xì)胞達(dá)到靶位發(fā)揮殺菌作用，這將為解決大腸埃希菌對(duì)抗生素的耐藥性問題提供新的思路。

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