蛞蝓膠囊大鼠長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)研究

周永恒 ，夏承來(lái) ，段才聞 ，嚴(yán)鵬科 *，謝金魁 *(.廣州醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 5050；.南華大學(xué)藥理研究所，湖南 衡陽(yáng) 4000)

蛞蝓(Limax)是一種危害農(nóng)作物有肺的軟體動(dòng)物，屬腹足類腹足綱蛞蝓科，我國(guó)各地有產(chǎn)。蛞蝓藥用在漢朝的《神農(nóng)本草經(jīng)》就已記載，此后《本草綱目》、《中藥大辭典》等均對(duì)蛞蝓有詳細(xì)論述。蛞蝓有清熱解毒、活血祛瘀、軟堅(jiān)散結(jié)等功能，常用于治療咳、喘、痰嗚、咽喉腫痛、半身不遂等癥，近年研究主要在肺癌、肺氣腫、支氣管炎、支氣管哮喘等方面。殷志等[1]研究證實(shí)蛞蝓提取物L(fēng)E對(duì)人肺癌A549細(xì)胞有生長(zhǎng)抑制作用；謝金魁等[2]研究提出蛞蝓提取物EL-3抗肺癌的作用機(jī)制是多靶點(diǎn)復(fù)合性的；本研究組[3]研究證實(shí)蛞蝓對(duì)實(shí)驗(yàn)性肺氣腫合并肺動(dòng)脈高壓具有較好治療作用，蛞蝓凍干粉對(duì)急性支氣管炎有較強(qiáng)的鎮(zhèn)咳和祛痰作用[4]；國(guó)外研究者僅利用蛞蝓作為嗅覺(jué)和味覺(jué)神經(jīng)調(diào)控的動(dòng)物模型來(lái)研究[5]。本試驗(yàn)受試物蛞蝓膠囊是以廣西百色地區(qū)足襞蛞蝓為原料制備的勻漿凍干制劑，按《藥品注冊(cè)管理辦法》注冊(cè)分類，屬中藥2類新藥。目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)有蛞蝓膠囊長(zhǎng)期毒性研究的文獻(xiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)旨在按《中藥、天然藥物長(zhǎng)期毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[6]和《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》開(kāi)展蛞蝓膠囊對(duì)大鼠的長(zhǎng)期毒性研究，探討蛞蝓膠囊重復(fù)用藥的長(zhǎng)期毒性，為后期的臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物

蛞蝓膠囊(南華大學(xué)藥物藥理研究所研制，批號(hào)：20101015)，臨床應(yīng)用途徑為口服，預(yù)期人臨床劑量 11.0 mg·kg-1·d-1，推薦臨床用藥時(shí)間為60 d。實(shí)驗(yàn)時(shí)取膠囊內(nèi)容物蛞蝓凍干粉用 0.9%生理鹽水配制成溶液供灌胃使用。

1.2 動(dòng)物

SD大鼠，清潔級(jí)，♀♂各半，體質(zhì)量(75.0±8.6)g，來(lái)源于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(湘)2003-0003。

1.3 儀器與試劑

BECKMAN全自動(dòng)生化分析儀(德國(guó)BECKMAN公司)；日立7110型血細(xì)胞分析儀(日本日立)；FA1004型電子天平(上海天平儀器廠)；1512型組織切片機(jī)(德國(guó)來(lái)卡公司)；OLYMPUSCH顯微鏡攝影系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司)。

血細(xì)胞檢測(cè)稀釋液(中科院中生公司，批號(hào)：1002016)；血液生化檢測(cè)試劑分別為：血糖、總蛋白、總膽固醇、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶、肌酐、尿素氮(北京中生生物工程高技術(shù)公司產(chǎn)品，批號(hào)分別為：100202，100401，100125，100213，100217，100201，100201)。

2 方法

2.1 劑量設(shè)定

預(yù)期人臨床劑量 11.0 mg·kg-1·d-1，按標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物的等效劑量折算系數(shù)法計(jì)算出大鼠劑量為 70.0 mg·kg-1·d-1[7]。大鼠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)原則上低劑量大于等效劑量或者最低有效劑量，高劑量一般為低劑量的10倍左右，中劑量為高、低劑量的對(duì)數(shù)中位數(shù)[8]，計(jì)算出低、中、高劑量(175.0，553.0，1 750.0 mg·kg-1)。

2.2 動(dòng)物分組、給藥、飼養(yǎng)與抽樣

取SD大鼠160只，♀♂各半，將動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)2周，均衡隨機(jī)分成4組，每組40只。4組大鼠分別給 0.9%生理鹽水(對(duì)照組)，蛞蝓膠囊175.0，553.0，1 750.0 mg·kg-1，給藥容積均為 10.0 mL·kg-1；每日上午 9∶00~10∶00 定時(shí) 1 次灌胃給藥，每周給藥6 d，連續(xù)給藥26周，并停藥觀察4周。每周根據(jù)大鼠體質(zhì)量變化調(diào)整給藥量。動(dòng)物在清潔級(jí)動(dòng)物室中飼養(yǎng)，喂全價(jià)顆粒飼料，飲冷開(kāi)水；實(shí)驗(yàn)室溫度19~24 ℃，濕度50%~70%。于第13周給藥后夜間禁食，自由飲水。次日每組取♀♂各5只測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(26周)每組取♀♂各10只測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)；恢復(fù)期觀察1個(gè)月(4周)，每組取剩余動(dòng)物測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

①一般觀察指標(biāo)。給藥期間，每日觀察動(dòng)物存活、外觀、行為、活動(dòng)、毛色、精神狀態(tài)、呼吸、糞便情況；每周稱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重 1次；每周稱剩余飼料并計(jì)算平均每日每只大鼠進(jìn)食量。②血液學(xué)、生化學(xué)和尿常規(guī)檢測(cè)。分別于給藥第 13周、26周和恢復(fù)期4周后，進(jìn)行血液學(xué)指標(biāo)[紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)、血紅蛋白計(jì)數(shù)及分類、淋巴細(xì)胞(LYM)、中性粒細(xì)胞(GRAN)、單核細(xì)胞(MID，含單核細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞及其他白細(xì)胞前體)、血小板(PLT)、出凝血時(shí)間(CT、PT)]、生化學(xué)指標(biāo)[谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總蛋白(TP)、尿素氮(BUN)、肌酐(UREA)、總膽固醇(CHOL)、甘油三脂(TG)、血糖(GLU)、肌酸激酶(CK)，鉀(K)]和尿液分析(尿膽原、膽紅素、酮體、隱血、蛋白質(zhì)、葡萄糖、pH、亞硝酸鹽、紅細(xì)胞、白細(xì)胞)。③解剖學(xué)、病理學(xué)檢查，分別于第13周、第26周、恢復(fù)期4周，處死各組部分動(dòng)物進(jìn)行系統(tǒng)解剖學(xué)和病理組織學(xué)檢查。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

體質(zhì)量、攝食量、血液學(xué)、血清生化學(xué)指標(biāo)和臟器系數(shù)均為計(jì)量資料，用±s 表示，根據(jù)方差分析結(jié)果，各組之間進(jìn)行t檢驗(yàn)。用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，比較給藥組與對(duì)照組均數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)大鼠一般狀況、行為活動(dòng)及死亡的影響

試驗(yàn)期間各組與對(duì)照組比較，各給藥組在給藥26周和恢復(fù)期4周的觀察中，外觀、行為、活動(dòng)毛色、精神狀態(tài)、呼吸、糞便的性狀等均無(wú)明顯改變。對(duì)照組、給藥各組在給藥前、給藥 1~26周、恢復(fù)期4周內(nèi)均無(wú)動(dòng)物死亡。

3.2 對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

試驗(yàn)期間各組動(dòng)物體質(zhì)量均有增長(zhǎng)，與對(duì)照組比較，各給藥組在給藥26周和恢復(fù)期4周期間大鼠體質(zhì)量均無(wú)明顯影響，給藥組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

3.3 對(duì)大鼠進(jìn)食量的影響

與對(duì)照組比較，各給藥組在給藥期和恢復(fù)期期間大鼠進(jìn)食量均無(wú)明顯影響，給藥組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

3.4 對(duì)一般血液學(xué)指標(biāo)的影響

與對(duì)照組比較，各給藥組在實(shí)驗(yàn)中期、實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诤屯Ｋ幓謴?fù)期 4周期間，各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)(RBC、WBC，血紅蛋白計(jì)數(shù)及分類，LYM，GRAN，MID，PLT，CT、PT)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均>0.05)。

3.5 對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響

與對(duì)照組比較，各給藥組在實(shí)驗(yàn)中期、實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诤屯Ｋ幓謴?fù)期4周期間，各項(xiàng)生化指標(biāo)(ALT，AST，TP，BUN，UREA，CHOL，TG，GLU，CK，K)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

3.6 對(duì)大鼠尿液的影響

與對(duì)照組比較，各給藥組在實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)中期、實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诤屯Ｋ幓謴?fù)期 4周期間，大鼠尿液各項(xiàng)指標(biāo)(尿膽原、膽紅素、酮體、隱血、蛋白質(zhì)、葡萄糖、pH、亞硝酸鹽、紅細(xì)胞、白細(xì)胞)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.7 對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響

于實(shí)驗(yàn)中期、實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)、停藥恢復(fù)期觀察4周后，處死各組部分動(dòng)物進(jìn)行系統(tǒng)解剖檢查發(fā)現(xiàn)：各組動(dòng)物發(fā)育良好，口、鼻、眼、耳未見(jiàn)異常分泌物，各臟器(腦、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、睪丸、附睪、子宮、卵巢)肉眼未見(jiàn)明顯形態(tài)學(xué)改變。給藥組與對(duì)照組比較，各臟器系數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.8 對(duì)大鼠臟器病理組織學(xué)的影響

在給藥的第13、26周和恢復(fù)期4周，取動(dòng)物臟器用 10%甲醛溶液固定，其中對(duì)照組和高劑量組器官予石臘包埋，常規(guī)切片、HE染色，用OLYMPUS-CH顯微鏡攝影系統(tǒng)進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。肉眼觀察，組織表面與切面均未見(jiàn)異常改變。腦、垂體、脊髓、胸腺、甲狀腺、甲狀旁腺、食管、唾液腺、胃、小腸、大腸、肝、胰腺、腎、腎上腺、脾、心、氣管、肺、主動(dòng)脈、睪丸、附睪、前列腺、子宮、乳腺、卵巢、膀胱、坐骨神經(jīng)、視神經(jīng)、骨髓、淋巴結(jié)等實(shí)質(zhì)性臟器給藥組與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異，未見(jiàn)急性和慢性中毒性損傷樣病理改變。

4 討論

長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)是藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)的核心內(nèi)容，是藥物從藥學(xué)研究進(jìn)入臨床試驗(yàn)的重要環(huán)節(jié)。本試驗(yàn)通過(guò)大鼠重復(fù)給藥表征蛞蝓膠囊的毒性作用，預(yù)測(cè)其可能對(duì)人體產(chǎn)生的不良反應(yīng)，降低臨床試驗(yàn)受試者和藥品上市后使用人群的用藥風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果蛞蝓膠囊按低劑量 175.0 mg·kg-1、中劑量 553.0 mg·kg-1、高劑量 1 750.0 mg·kg-1給大鼠連續(xù)灌胃給藥 26周，停藥恢復(fù) 4周，給藥組與對(duì)照組比較，大鼠的外觀體征、腺體分泌、呼吸、糞便、飼料的日消耗量、給藥局部反應(yīng)等均未見(jiàn)異常。給藥組體質(zhì)量增長(zhǎng)正常，血常規(guī)及血液生化檢查，與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。主要臟器的病理組織學(xué)檢查，未見(jiàn)因藥物毒性引起的明顯病理改變。結(jié)果提示：蛞蝓膠囊對(duì)大鼠灌胃給藥的安全劑量是 1 750.0 mg·kg-1。

本次實(shí)驗(yàn)的高劑量 1 750.0 mg·kg-1按千克體質(zhì)量折算相當(dāng)于70 kg成人臨床用藥劑量159倍，一般認(rèn)為，按體質(zhì)量計(jì)算，大鼠1 d內(nèi)最大給藥量相當(dāng)于成人臨床日用劑量的 100倍以上是較安全的[9]。綜上所述，蛞蝓膠囊對(duì)大鼠長(zhǎng)期反復(fù)用藥無(wú)明顯的毒性作用，可預(yù)測(cè)臨床劑量以 11.0 mg·kg-1·d-1，連續(xù)用藥為 60 d，是比較安全的。

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