膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠的淋巴組織中CD4＋T細(xì)胞表達(dá)酪氨酸羥化酶的變化*

陳 娟，彭聿平，崔世維，包，邱一華△

（1.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，江蘇南通226001；2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇南通226001；3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇淮安223001）

長期以來兒茶酚胺被認(rèn)為是由神經(jīng)和內(nèi)分泌細(xì)胞合成和釋放的一類調(diào)節(jié)物。然而，近十多年來的研究發(fā)現(xiàn)，淋巴細(xì)胞也能合成和分泌兒茶酚胺［1，2］。本實(shí)驗(yàn)室先前已報(bào)道，T淋巴細(xì)胞表達(dá)兒茶酚胺合成的限速酶--酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH），而且可合成和釋放兒茶酚胺，包括去甲腎上腺素、腎上腺素和多巴胺，它們對(duì)T細(xì)胞的增殖、分化和凋亡產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用［3-6］。已知類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的慢性自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制主要與CD4＋T細(xì)胞中各類亞群的功能失衡有關(guān)。如前所述，在正常情況下T細(xì)胞來源的兒茶酚胺可調(diào)節(jié)免疫功能，那么在RA慢性自身免疫性疾病的發(fā)生與發(fā)展中，T細(xì)胞是否發(fā)生兒茶酚胺合成的改變，目前尚不十分清楚。據(jù)此，本研究利用RA的小鼠模型--膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA），觀察CIA疾病過程中CD4＋T細(xì)胞表達(dá)TH的變化，從而為T細(xì)胞來源的兒茶酚胺參與RA的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

DBA／1小鼠雄性，6～8周齡，體重為（18±2）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，SPF級(jí)，室內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后用于實(shí)驗(yàn)。將體重相近的DBA／1小鼠隨機(jī)分為未處理空白組、佐劑組、35 d模型組和55 d模型組。

1.2 主要試劑與儀器

雞Ⅱ型膠原（collagenⅡ，CⅡ）購自 Sigma公司；佛氏完全佐劑（complete freund′s adjuvant，CFA）購自Chondrex公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）購自Sigma公司；小鼠抗TH單克隆抗體購自Millipore公司；大鼠抗小鼠 CD4抗體購自 AbD Serotec公司；FITC羊抗小鼠抗體購自Sigma公司；羅丹明標(biāo)記山羊抗大鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Leica倒置研究型顯微鏡、CM 1900型冰凍切片機(jī)購自德國 Leica公司。

1.3 CIA模型制備

取CⅡ溶于0.1 mol／L的冰醋酸溶液中使終質(zhì)量濃度為2mg／ml，置4℃儲(chǔ)存過夜。取上述 CⅡ溶液與CFA等體積混合，于冰上充分乳化制成膠原乳劑。免疫動(dòng)物時(shí)，在小鼠尾根部多點(diǎn)皮內(nèi)注射0.1 ml膠原乳劑，基礎(chǔ)免疫后第21天在腹腔注射該膠原乳劑0.1ml進(jìn)行加強(qiáng)免疫，為了加速關(guān)節(jié)炎發(fā)生分別于第28天、第32天腹腔注射LPS 20μg。佐劑組是用CFA與0.1 mol／L的冰醋酸溶液等體積充分乳化后于實(shí)驗(yàn)第1天在每只小鼠的尾根部多點(diǎn)皮內(nèi)注射0.1ml乳劑，第21天在腹腔注射該乳劑0.1ml。

1.4 關(guān)節(jié)炎癥的觀察和臨床評(píng)分

小鼠在初次免疫后每天觀察前后足的病變情況；并在初次免疫后第22天開始，每3 d進(jìn)行關(guān)節(jié)炎癥的臨床評(píng)分，各關(guān)節(jié)病變程度按4級(jí)評(píng)分法［7］。“0”：所有的關(guān)節(jié)無任何腫脹或變紅；“1”：輕度的紅和（或）腫；“2”：明顯的紅腫；“3”：關(guān)節(jié)僵硬或畸形強(qiáng)直。每只小鼠所有關(guān)節(jié)均被評(píng)分，最高分為12分。

1.5 踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)檢查

小鼠在初次免疫后第35天和55天分別處死，取踝關(guān)節(jié)，剝離皮膚后，去除多余的皮下組織，關(guān)節(jié)用4%多聚甲醛固定，10%EDTA脫鈣，切片，HE染色，光鏡下觀察組織病理變化。

1.6 免疫熒光組織化學(xué)染色

小鼠在初次免疫后第35天或55天，用復(fù)合麻醉劑2ml進(jìn)行腹腔麻醉后，灌注、固定、取腸系膜淋巴結(jié)和脾臟，冰凍切片，片厚20μm，PBS漂洗，加山羊血清封閉30 min，PBS漂洗，加一抗即小鼠抗TH單克隆抗體（1∶150稀釋）和大鼠抗小鼠CD4抗體（1∶300稀釋），室溫孵育 18～24 h，PBS漂洗，加二抗即FITC羊抗小鼠抗體（1∶100稀釋）和羅丹明標(biāo)記山羊抗大鼠 IgG（1∶150稀釋），室溫孵育4 h，PBS漂洗3次，上述抗體均用0.01 mol／L PBS稀釋。將上述處理過的組織切片裱于經(jīng)明膠處理過的載玻片上，用封片劑封片。在同一視野熒光顯微鏡下觀察，淋巴結(jié)和脾臟各切片隨機(jī)選擇5個(gè)區(qū)域進(jìn)行照相，然后統(tǒng)計(jì)每張切片中陽性細(xì)胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件中單因素方差（one-way ANOVA）分析進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和比較。

2 結(jié)果

2.1 DBA／1小鼠注射膠原乳劑后關(guān)節(jié)炎癥的觀察

小鼠的關(guān)節(jié)紅腫多發(fā)生于初次免疫后的第29～32天，首先是前足紅腫，以后延伸至后足，亦可同時(shí)出現(xiàn)，病變可累及足墊、趾間關(guān)節(jié)及踝關(guān)節(jié)，并逐漸加重，于初次免疫后第46天左右紅腫達(dá)到高峰；初次免疫后35 d和初次免疫后55 d小鼠關(guān)節(jié)紅腫無明顯差異（圖1）。而正常組和佐劑組無關(guān)節(jié)紅腫表現(xiàn)（圖1）。另外，在發(fā)病過程中，模型小鼠出現(xiàn)飲食及運(yùn)動(dòng)減少、舔足、毛色失去光澤、尾根部注射處有潰爛等現(xiàn)象。

2.2 DBA／1小鼠注射膠原乳劑后關(guān)節(jié)炎癥的臨床評(píng)分

小鼠自初次免疫后第22天開始，每3 d進(jìn)行關(guān)節(jié)炎癥的臨床評(píng)分。可見DBA／1小鼠注射膠原乳劑后足爪分值從第29天開始升高，第46天達(dá)高峰，臨床評(píng)分達(dá)8.8分，與足爪腫脹外觀一致；而正常組和佐劑組均為0分（圖2）。

Fig.1 Photographs of swelling paws of DBA／1mice with CIA CIA：Collagen-induced arthritis

Fig.2 Change in clinical scores of arthritis in process of CIA（n＝5）

2.3 DBA／1小鼠注射膠原乳劑后踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)的改變

小鼠在初次免疫后第35天和55天分別處死，取踝關(guān)節(jié)，標(biāo)本經(jīng)固定、脫鈣、切片并進(jìn)行HE染色。觀察病理切片發(fā)現(xiàn)CIA小鼠在發(fā)病早期（初次免疫后第35天）和發(fā)病晚期（初次免疫后第55天）其關(guān)節(jié)滑膜組織中炎性細(xì)胞浸潤、滑膜組織增生、關(guān)節(jié)間隙變窄、部分關(guān)節(jié)軟骨破壞；而正常組和佐劑組可見關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)清楚，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤、滑膜組織增生和軟骨破壞等異常改變（圖3）。

2.4 CIA小鼠腸系膜淋巴結(jié)中CD4＋T細(xì)胞表達(dá)TH增加

與正常組和佐劑對(duì)照組相比，CIA小鼠在發(fā)病早期和發(fā)病晚期均出現(xiàn)腸系膜淋巴結(jié)中TH＋細(xì)胞數(shù)目明顯增多，而且CD4＋T淋巴細(xì)胞數(shù)目也顯著增加（圖4，表1）。我們將 TH＋細(xì)胞和CD4＋T淋巴細(xì)胞進(jìn)行共定位，發(fā)現(xiàn)在正常淋巴結(jié)中，有TH＋和CD4＋細(xì)胞的共定位，證明CD4＋T細(xì)胞表達(dá)TH。在CIA小鼠的發(fā)病早期和發(fā)病晚期，淋巴結(jié)中具有TH＋和CD4＋共定位的細(xì)胞數(shù)均顯著多于正常組和佐劑對(duì)照組（圖4，表1），說明在 CIA發(fā)病過程中，CD4＋T細(xì)胞表達(dá)TH增加。在CIA小鼠的發(fā)病早期與發(fā)病晚期之間，TH＋細(xì)胞、CD4＋T細(xì)胞及它們共定位的細(xì)胞數(shù)目均沒有顯著性差異（圖4，表1）。

Fig.3 Histopathological changes in ankle jointof CIA（HE staining）

Fig.4 The expression of TH and CD4 in the mesenteric lymph nodes detected by double immunofluorescence staining（×200，insert×400）

2.5 CIA小鼠脾臟中CD4＋T細(xì)胞表達(dá)TH增加

與正常組和佐劑對(duì)照組相比，CIA小鼠在發(fā)病早期和發(fā)病晚期均出現(xiàn)脾臟中TH＋細(xì)胞數(shù)目明顯增多，并且CD4＋T淋巴細(xì)胞數(shù)目也顯著增加（圖5，表2）。我們將TH＋細(xì)胞和CD4＋T淋巴細(xì)胞進(jìn)行共定位，發(fā)現(xiàn)在正常脾臟中，有TH＋和CD4＋細(xì)胞的共定位，證明CD4＋T細(xì)胞表達(dá)TH。在CIA小鼠的發(fā)病早期和發(fā)病晚期，脾臟中具有TH＋和CD4＋共定位的細(xì)胞數(shù)均顯著多于正常組和佐劑對(duì)照組（圖5，表2），說明在CIA發(fā)病過程中，CD4＋T細(xì)胞表達(dá)TH增加。在CIA小鼠的發(fā)病早期與發(fā)病晚期之間，TH＋細(xì)胞、CD4＋T細(xì)胞及它們共定位的細(xì)胞數(shù)目均沒有顯著性差異（圖5，表2）。

Tab.1 Changes in number of TH／CD4 double-positive cells in themesenteric lymph nodes of CIAmice（±s，n＝4）

Tab.1 Changes in number of TH／CD4 double-positive cells in themesenteric lymph nodes of CIAmice（±s，n＝4）

TH：Tyrosine hydroxylase；CIA：Collagen-induced arthritis*P＜0.05，**P＜0.01 vs intact；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs vehicle

Group Number of TH＋cells double-positive cells Intact 27.00±10.80 19.75±9.95 14.00±4.83 Vehicle 30.00±13.74 22.75±13.57 16.25±5.97 Day 35 after immunization 127.50±60.89**＃＃ 89.00±51.06**＃＃ 51.00±21.65**＃＃Day 55 after immunization 104.00±27.51**＃ 78.25±19.92*＃ 52.75±15.90**＃＃Number of CD4＋cells Number of TH／CD4

Tab.2 Changes in number of TH／CD4 double-positive cells in the spleen of CIAmice（±s，n＝4）

Tab.2 Changes in number of TH／CD4 double-positive cells in the spleen of CIAmice（±s，n＝4）

TH：Tyrosine hydroxylase；CIA：Collagen-induced arthritis*P＜0.05，**P＜0.01 vs intact；＃P＜0.05 vs vehicle

Group Number of TH＋cells double-positive cells Intact 14.25±3.40 9.75±4.03 6.00±2.58 Vehicle 14.50±4.12 11.75±2.50 5.25±1.71 Day 35 after immunization 28.75±11.79*＃ 21.75±5.74**＃ 13.25±6.75*＃Day 55 after immunization 25.75±5.56*＃ 20.50±6.61*＃ 13.50±4.80*＃Number of CD4＋cells Number of TH／CD4

Fig.5 Expression of TH and CD4 in the spleen detected by double immunofluorescence assay（×200，insert×400）

3 討論

神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)主要通過合成和釋放遞質(zhì)、激素、細(xì)胞因子等發(fā)生相互作用從而調(diào)節(jié)生物體的生理功能。兒茶酚胺包括去甲腎上腺素、腎上腺素和多巴胺，它們主要由神經(jīng)和內(nèi)分泌細(xì)胞合成和釋放。但近十多年來的研究說明，免疫細(xì)胞也能產(chǎn)生兒茶酚胺，并對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用［1-2］。免疫細(xì)胞具有與神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞類似地合成和降解兒茶酚胺的酶系統(tǒng)。例如，用TH抑制劑α-甲基酪氨酸預(yù)孵育T或B淋巴細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)兒茶酚胺的含量明顯下降，提示淋巴細(xì)胞內(nèi)兒茶酚胺的合成依賴于TH［8］。我們先前已報(bào)道，淋巴細(xì)胞能表達(dá)兒茶酚胺合成的限速酶—TH；同時(shí)直接檢測(cè)到培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞內(nèi)和上清液中有去甲腎上腺素、腎上腺素和多巴胺，表明淋巴細(xì)胞可合成和分泌兒茶酚胺；淋巴細(xì)胞合成和分泌的兒茶酚胺對(duì)T細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞因子的產(chǎn)生發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［3-6］。然而，淋巴細(xì)胞來源的兒茶酚胺是否參與免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。

RA是一個(gè)累及周圍關(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)性炎癥性的自身免疫病，臨床表現(xiàn)為受累關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、功能下降，病變呈持續(xù)、反復(fù)發(fā)作的過程，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。1980年Courtenay等建立了小鼠CIA模型，極大的推進(jìn)了RA發(fā)病機(jī)制和治療的研究。小鼠CIA作為類似于RA的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，表現(xiàn)為多發(fā)性外周關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)局部紅腫，嚴(yán)重致關(guān)節(jié)畸形。病理變化為增生性滑膜炎，關(guān)節(jié)軟骨破壞、骨侵蝕，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤，體內(nèi)可檢出針對(duì)Ⅱ型膠原的高滴度的IgG抗體，這些臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)指標(biāo)與人類RA密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中我們以雞的CⅡ免疫6～8周雄性DBA／1小鼠，免疫后模型組多于第29～32天開始出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫等關(guān)節(jié)炎癥表現(xiàn)，關(guān)節(jié)炎評(píng)分逐漸升高，第46天達(dá)到高峰，觀察病理切片發(fā)現(xiàn)CIA小鼠在發(fā)病早期和發(fā)病晚期其關(guān)節(jié)滑膜組織中有大量炎性細(xì)胞浸潤，滑膜組織增生，關(guān)節(jié)間隙變窄，部分關(guān)節(jié)軟骨破壞。這些病理改變及體征與文獻(xiàn)報(bào)道一致，提示CIA模型制備成功。

Miller等［9］報(bào)道，RA病人的關(guān)節(jié)滑膜組織中巨噬細(xì)胞釋放去甲腎上腺素，而且隨著關(guān)節(jié)炎癥的加重，巨噬細(xì)胞釋放去甲腎上腺素增加。這一研究提示作為固有免疫細(xì)胞的巨噬細(xì)胞可合成和釋放兒茶酚胺，這些兒茶酚胺與RA的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。CD4＋T細(xì)胞是適應(yīng)性免疫細(xì)胞--T細(xì)胞的一種亞群。我們研究發(fā)現(xiàn)，在正常小鼠的淋巴結(jié)和脾臟中，也存在TH＋和CD4＋共定位的細(xì)胞，但在CIA小鼠的發(fā)病早期和發(fā)病晚期，其腸系膜淋巴結(jié)和脾臟中的TH＋細(xì)胞數(shù)目和CD4＋T細(xì)胞數(shù)目顯著增多，而且TH＋和CD4＋共定位的細(xì)胞數(shù)目也明顯增多。這些結(jié)果不但說明在正常淋巴組織中CD4＋T細(xì)胞能合成兒茶酚胺，而且提示T細(xì)胞合成的兒茶酚胺也參與了RA的疾病過程，因而為適應(yīng)性免疫細(xì)胞來源的兒茶酚胺涉及 RA的發(fā)生及轉(zhuǎn)歸提供了證據(jù)。最近，Capellino等［10］報(bào)道在 RA疾病的初期，關(guān)節(jié)炎局部的細(xì)胞產(chǎn)生兒茶酚胺增加，這些兒茶酚胺具有很強(qiáng)的抗炎作用。因此，我們推測(cè)在RA疾病過程中T細(xì)胞合成兒茶酚胺增加是一種局部的抗炎機(jī)制。

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