液相色譜串聯(lián)電化學(xué)檢測(cè)器測(cè)定人體血漿和尿液兒茶酚胺濃度

王玲　陽(yáng)愿望

【摘要】目的：建立一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確的測(cè)定人體血漿、尿中兒茶酚胺的方法，為臨床檢測(cè)和研究提供技術(shù)支持。方法：采用活性氧化鋁（AL₂O₃）對(duì)血漿和尿液標(biāo)本中的兒荼酚胺進(jìn)行酸解吸附、凈化，利用離子對(duì)反相高效液相色譜串聯(lián)電化學(xué)檢測(cè)器法（RP-HPLC-ECD）對(duì)其測(cè)定，工作電壓+0.80V，靈敏度50nA，以外標(biāo)法定量。結(jié)果：去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺分離良好，出峰時(shí)間分別為8分鐘、9分鐘、11分鐘，且不受體內(nèi)其他內(nèi)源性物質(zhì)及代謝物干擾。樣本在2.0-100ng/ml濃度范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系，分離參數(shù)R≥1.5，其方法絕（相）對(duì)回收率分別為82.5-104.4%、83.4-100.7%、77.0-91.8%，最低檢測(cè)濃度1.0ng/ml。結(jié)論：RP-HPLC-ECD檢測(cè)人體血漿、尿中兒茶酚胺具有操作簡(jiǎn)便，分析快速，特異性高，重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】?jī)翰璺影?；反相高效液相色譜；嗜鉻細(xì)胞瘤

單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)兒茶酚胺類(lèi)（Catecholamines，CAs）化合物，主要包括去甲腎上腺素（NE）、腎上腺素（E）、多巴胺（DA）。它是人類(lèi)中樞神經(jīng)重要的信息傳遞物質(zhì)，不僅直接參與植物神經(jīng)功能的調(diào)控，還與許多功能型疾病有關(guān)。血漿和尿液中的CAs含量不但可作為嗜鉻細(xì)胞瘤的診斷依據(jù)，而且可應(yīng)用于其他與兒茶酚胺有關(guān)疾病的研究，對(duì)研究這類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的生理功能及其代謝變化具有重要意義。傳統(tǒng)的熒光法與放射免疫測(cè)定法（Radio-immunassay，RIA），氣相色譜法（GC），或步驟繁瑣，或價(jià)格昂貴不易實(shí)現(xiàn)。由于電化學(xué)檢測(cè)器的高靈敏度，使該類(lèi)化合物體內(nèi)微量分析得以應(yīng)用。本文建立的RP-HPLC-ECD測(cè)定人體血漿及尿中的兒茶酚胺，具有方法簡(jiǎn)單，快速，專(zhuān)一，在應(yīng)用中重復(fù)性較好，適用于臨床測(cè)定及研究人體內(nèi)兒茶酚胺的代謝分析。

1儀器與材料

1.1儀器

美國(guó)Waters e2695型高效液相色譜系統(tǒng)、Waters2465電化學(xué)檢測(cè)器及Empower2色譜數(shù)據(jù)處理工作站。XW-80A旋渦混合儀（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司），DL-8M低速冷凍離心機(jī)（上海市離心機(jī)械研究所有限公司）。

兒茶酚胺（NE、E、DA）標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司）；AL₂O₃、Tris進(jìn)口分裝；甲醇、乙腈、冰乙酸、EDTA-Na2、B8（辛烷磺酸鈉）以上均為進(jìn)口色譜純；濃鹽酸、無(wú)水NaAc為國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)純或分析純?cè)噭?，試?yàn)用水為娃哈哈596ml裝飲用純凈水。

2方法與結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取NE、E、DA標(biāo)準(zhǔn)品用0.1mol/L HCL配制成1μg/ml的CAs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分裝后置于-70℃冰箱長(zhǎng)期保存。臨使用時(shí)用0.1mol/L HCL溶液稀釋成終濃度分別為100.0、50.0、20.0、5.0、2.0ng/ml五個(gè)濃度梯度。

2.2 Tris-HCL緩沖液的配制

稱(chēng)取Tris 12.114 g用0.1mol/HCL溶解配制成1.OmoFl Tris-HCL緩沖液，調(diào)PH值至8.9。

2.3氧化鋁的活化

參照Anton等方法，稱(chēng)100g氧化鋁于1000ml燒杯中，加2moFl HCL 500ml，90℃攪拌45min，冷卻，棄上清液及懸浮粒；加2mol/l HCL 250ml，70℃攪拌10mm，冷卻，棄上清液及懸浮粒，共兩次；加2mol/1 HCL 500ml，50℃攪拌10mm，冷卻，棄上清液及懸浮粒；反復(fù)用純水200ml/次，洗滌至PH≈3.4。將氧化鋁轉(zhuǎn)至蒸發(fā)皿，120℃烤1h，200℃烤2h，冷卻后在室溫下干燥貯存。每次做試驗(yàn)前取部分氧化鋁200～C烤2h進(jìn)行活化，冷卻至室溫，后稱(chēng)活化的氧化鋁20mg/管至15ml塑料刻度試管中備用。

2.4色譜條件

分析柱，C18柱（Hypersil ODS2 5μm4.6*250mm，大連依利特科學(xué)儀器有限公司）。流動(dòng)相：無(wú)水NaAc4.1g，EDTA-Na250mg，B8 80mg，冰乙酸7.5ml，乙腈80ml，加試驗(yàn)用水至1000ml，調(diào)節(jié)PH值至4.2，0.22μm濾膜過(guò)濾后超聲脫氣。流速0.45ml/min；電化學(xué)檢測(cè)器工作電壓+0.80V，Ag/AgCL為參比電極，Range=50 nA，柱溫40℃。此條件下NE、E、DA分離良好，如圖1a，圖1b所示。

2.5樣品處理

2.5.1標(biāo)本收集

血漿標(biāo)本，宜在空腹臥床休息30min后抽取靜脈血，EDTA抗凝，4℃3500r/min，立即離心5分鐘，分離血漿后置-20℃凍存，檢測(cè)時(shí)室溫復(fù)融；尿液標(biāo)本，在容器中以5-10ml濃鹽酸作防腐處理，收集24小時(shí)尿并記錄尿量，混勻，取10ml置-20℃凍存，檢測(cè)時(shí)室溫復(fù)融。

2.5.2樣品處理

在2.3項(xiàng)下已加入活化氧化鋁的15ml塑料刻度試管內(nèi)加入0.4ml Tris-HCL緩沖液，取抗凝血，離心分離血漿1-2ml（離心后的尿液0.2ml），旋渦振蕩15min，使兒茶酚胺吸附在氧化鋁上，離心10min，棄上清液，沉淀用5ml試驗(yàn)用水（預(yù)冷）洗滌4次，離心，小心用棉簽盡量吸干水相，沉淀加入0.2 mol/l的HCL 0.2 ml，旋渦振蕩15min，將吸附于氧化鋁上的兒茶酚胺解析下來(lái)，離心，取20lxl洗脫液用于進(jìn)樣，根據(jù)外標(biāo)法定量。

2.6結(jié)果

2.6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

血漿：分別取空白血漿1.0ml及空白尿樣0.2ml置15ml塑料刻度試管內(nèi)，將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用0.1mol/HCL溶液稀釋成如“2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)工作液，混勻后照“2.5.2樣品處理”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣，以外標(biāo)法峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸。CAs濃度在2.0-100ng/ml濃度范圍內(nèi)線性良好，結(jié)果如表1示。

2.6.2精密度和重復(fù)性

取同一濃度標(biāo)準(zhǔn)品分多次在相同的試驗(yàn)日和不同的試驗(yàn)日測(cè)定，得方法重復(fù)性；按處理方法反復(fù)測(cè)定得日內(nèi)變異系數(shù)（n=20）為1.44～2.48%，日問(wèn)變異系數(shù)（n=20）為3.51～7.63%。結(jié)果如表2示。

2.6.3方法回收率

取空白血漿、尿液作基質(zhì)，用配成的（低、中、高）三種濃度分別為5.0、10.0、50.0ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)液分別加樣，按樣品處理方法處理測(cè)定，用實(shí)測(cè)濃度比加入濃度即得回收率。結(jié)果如表3所示。

3討論

（1）本實(shí)驗(yàn)采用酸性活化氧化鋁萃取的方法進(jìn)行生物樣品中的兒茶酚胺類(lèi)化合物提取，活化效果滿(mǎn)意，回收率與文獻(xiàn)報(bào)道相近。

（2）色譜系統(tǒng)檢測(cè)條件設(shè)置多樣，其中色譜柱種類(lèi)、柱效、流動(dòng)相PH、離子對(duì)濃度、有機(jī)相比例等都是影響兒茶酚胺分離和定量的重要因素吲。本法取C18材料反相離子對(duì)色譜柱，流動(dòng)相PH4.2，乙腈8%，分離和檢測(cè)效果良好。采用國(guó)產(chǎn)色譜柱大幅降低成本。

（3）本法樣品回收穩(wěn)定，峰圖分離完全，檢測(cè)電化學(xué)反應(yīng)呈良好線性關(guān)系和重現(xiàn)性，回收率分別為82.5-104.4%、83.4-100.7%、77.0-91.8%，回收率較高，精密度<8%，最低檢出限達(dá)40pg，全部峰圖在12分鐘內(nèi)出齊，表明本法具良好特異性、穩(wěn)定性和靈敏性，檢測(cè)速度也較寬，線性范圍（2.0-100ng/ml）較寬，能滿(mǎn)足臨床需求。

（4）對(duì)本實(shí)驗(yàn)樣品的要求及固相萃取前處理時(shí)的一些注意事項(xiàng)：本實(shí)驗(yàn)對(duì)血漿標(biāo)本要求嚴(yán)格，抽取靜脈血后應(yīng)立即在低溫條件下分離血漿并即時(shí)送檢，-20℃凍存待測(cè)，避免反復(fù)凍融。標(biāo)本送檢不及時(shí)或未立即分離血漿對(duì)結(jié)果有較大影響，脂濁標(biāo)本對(duì)氧化鋁萃取分離（導(dǎo)致回收率降低）和檢測(cè)結(jié)果均有影響。由于NE、E、DA有兩個(gè)鄰位酚羥基，極易被氧化，而且氧化劑、熱、光、堿都會(huì)加速其氧化分解，故有條件時(shí)應(yīng)在避光及低溫條件下進(jìn)行操作處理樣本。

（5）對(duì)制備好的實(shí)驗(yàn)樣品的保存及降解情況作統(tǒng)計(jì)，證實(shí)樣品在48h之內(nèi)無(wú)論4℃存放還是-70℃，其含量變化不大，72h后含量變化有統(tǒng)計(jì)意義。因此制備好的樣品在3d內(nèi)檢測(cè)比較準(zhǔn)確。