高效液相熒光法測(cè)定人尿液中兒茶酚胺含量

成利娟，黃　燕，許杜娟，，宋禮華，夏　泉，韓衛(wèi)星，杜俊華

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥　230032；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥　230022；

3.安徽安科生物工程(集團(tuán))股份有限公司，安徽 合肥　230088；4.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科；

5.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，安徽 合肥　230022)

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高效液相熒光法測(cè)定人尿液中兒茶酚胺含量

成利娟1，黃燕2，許杜娟1，2，宋禮華3，夏泉2，韓衛(wèi)星4，杜俊華5

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥230032；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥230022；

3.安徽安科生物工程(集團(tuán))股份有限公司，安徽 合肥230088；4.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科；

5.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，安徽 合肥230022)

摘要：目的建立高效液相色譜-熒光檢測(cè)(HPLC-FD)法同時(shí)測(cè)定人尿液中兒茶酚胺(去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺)含量，用于嗜鉻細(xì)胞瘤的診斷。方法自制活性氧化鋁，在弱堿性Tris緩沖液條件下吸附尿液樣本中兒茶酚胺，使用 ZORBAX-SB (4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱，以甲醇-20 mmol·L-1磷酸二氫鉀溶液為流動(dòng)相；流速：0.8 mL·min-1，柱溫25℃；激發(fā)波長(zhǎng)(EX)為286 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)(EM)為318 nm。 結(jié)果重酒石酸去甲腎上腺素、腎上腺素、鹽酸多巴胺在1.56～1 000 μg·L-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 5、0.999 7、0.999 8)；日內(nèi)及日間精密度RSD在0.31%～8.02%之間；高、中、低三個(gè)濃度的平均方法回收率在94.22%～108.69%之間。 結(jié)論該方法準(zhǔn)確，穩(wěn)定性較好，線性范圍廣，為嗜鉻細(xì)胞瘤的診斷及圍手術(shù)期治療提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：兒茶酚胺；尿液；高效液相熒光檢測(cè)法；活性氧化鋁

機(jī)體內(nèi)兒茶酚胺類化合物(Catecholamines, CAs)主要包括去甲腎上腺素(norepinephrine, NE)、腎上腺素(epinephrine, E)、多巴胺(Dopamine, DA)。NE、E、DA是體內(nèi)重要的信息傳遞物質(zhì)，可由腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞以及交感神經(jīng)節(jié)處嗜鉻組織分泌，正常量的兒茶酚胺在維持機(jī)體多種生理功能平衡中起著極其重要的作用。而嗜鉻細(xì)胞瘤(pheoehromocytoma, PHEO)是一種大量分泌CAs的腫瘤，其患病率約為0.002%~0.008%，占高血壓患者的0.1%~0.5%[1]。PHEO患者體內(nèi)兒茶酚胺含量的過度增加可導(dǎo)致心血管、內(nèi)分泌、消化道等多系統(tǒng)并發(fā)癥，該類疾病因其臨床表現(xiàn)的多樣性及混雜性而具有很強(qiáng)的欺騙性，極容易導(dǎo)致漏診、誤診[2-3]；而其嚴(yán)重的心血管并發(fā)癥可危及生命，有文獻(xiàn)報(bào)道尸檢中發(fā)現(xiàn)PHEO的患病率可達(dá)0.05%，而在這0.05%的患者中有50%的死亡直接歸因于PHEO[4]。但該類腫瘤以良性為主，確診后可行手術(shù)切除，各系統(tǒng)并發(fā)癥隨之消失，因此，及時(shí)的診斷尤為重要[5]。本文建立的HPLC-FD 測(cè)定人尿液中兒茶酚胺, 方法簡(jiǎn)單、快速、專一, 適用于臨床測(cè)定，為嗜鉻細(xì)胞瘤的鑒別診斷提供可靠的依據(jù)。

1儀器和試劑

1.1儀器高效液相色譜儀：Waters e2695 配備Waters e2475 熒光檢測(cè)器；FA2104電子天平(上海天平儀器廠)；25BT S電子天平(德國(guó)塞多利斯)；離心機(jī)(DL-5低速大容量離心機(jī))；XW-80A 渦旋振蕩器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)；-40℃超低溫冰箱270L(美菱),氮吹儀(EYELA MG-2200)；4℃海爾冷藏柜(BC/BD-388A型)。

1.2試劑重酒石酸去甲腎上腺素(NE，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100169-201103)、腎上腺素(E，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100154-201104)、鹽酸多巴胺(DA，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100070-201006)；鹽酸異丙腎上腺素(IP，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100166-201004)；甲醇(色譜純，Tedia公司)；鹽酸、醋酸、磷酸二氫鉀、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)均為分析純；滅菌注射用水。

1.3檢測(cè)樣本正常人、非嗜鉻細(xì)胞瘤高血壓患者、嗜鉻細(xì)胞瘤患者的24 h尿液。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件[6]色譜柱：ZORBAX-SB (4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-20 mmol·L-1磷酸二氫鉀溶液(含EDTA-2Na 0.2 mol·L-1)=2 ∶98；流速：0.8 mL·min-1；激發(fā)波長(zhǎng)(EX)為286 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)(EM)為318 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20 μL。在此色譜條件下，重酒石酸去甲腎上腺素、腎上腺素、鹽酸多巴胺、鹽酸異丙腎上腺素出峰時(shí)間分別在3.4、4.6、7.8 、19.5 min，系統(tǒng)適應(yīng)性均符合要求，NE、E、DA分離度分別為：1.71， 3.05，4.73；NE、E、DA拖尾因子分別為：1.57，1.14，1.02；NE、E、DA理論塔板數(shù)分別為2 359，1 672，2 616,色譜峰見圖1。

2.2重酒石酸去甲腎上腺素、腎上腺素、鹽酸多巴胺混合貯備液及內(nèi)標(biāo)液的配制精密稱取重酒石酸去甲腎上腺素、腎上腺素、鹽酸多巴胺對(duì)照品適量，用0.2 mol·L-1醋酸溶液配制混合貯備液，濃度為10 mg·L-1，用1.5 mL離心管分裝，于-40℃超低溫冰箱內(nèi)避光保存，臨用時(shí)4℃解凍，用滅菌注射用水稀釋成所需濃度的工作液。

精密稱取鹽酸異丙腎上腺素適量，用0.2 mol·L-1醋酸溶液配制成10 mg·L-1的貯備液，用1.5 mL離心管分裝，于-40℃超低溫冰箱內(nèi)避光保存，臨用時(shí)4℃解凍，用滅菌注射用水稀釋成所需濃度。

2.3活性氧化鋁的制備[6]稱取20 g氧化鋁，加入100 mL(2 mol·L-1)鹽酸，100℃條件下，快速攪動(dòng)45 min，70℃條件下，用50 mL鹽酸(2 mol·L-1)洗滌15 min，2次；于50℃下用100 mL鹽酸(2 mol·L-1)洗滌1次，15 min，然后用總量為2 000 mL的滅菌注射用水洗滌多次(約30次)，至中性，傾去剩余水分，用濾紙將氧化鋁吸干，于350℃，4 h，自然冷卻后置干燥器皿內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.41 mol·L-1Tris(0.1%EDTA)溶液配制稱取30.275 mg Tris、0.25 g EDTA于燒杯中，滅菌注射用水溶解，6 mol·L-1的鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.50，于250 mL的容量瓶中用滅菌注射用水定容至刻度。

2.5樣品處理[7]分別吸取尿液1 mL于15 mL帶蓋離心管中，取10 μg·L-1鹽酸異丙腎上腺素(內(nèi)標(biāo))貯備液10 μL加入尿液中，渦旋混勻。用滅菌注射用水稀釋4倍，加入2 mL 1 mol·L-1Tris-EDTA溶液(含EDTA 0.1%)加入活化的氧化鋁20 mg,振蕩5 min,離心3 000 r×10 min，棄上清液并用濾紙吸盡離心管管壁上液相。加入4 mL滅菌注射用水洗滌，振蕩5 min, 離心3 000 r×10 min，棄上清并用濾紙吸盡液相。加入2 mL甲醇洗滌，振蕩5 min, 離心3 000 r×10 min，棄上清并用濾紙吸盡管壁液相，氮吹5 min。加入0.2 mol·L-1的HCl 100 μL,漩渦振蕩2 min, 離心3 000 r×10 min。按上述色譜條件，取上清液20 μL進(jìn)樣。

2.6專屬性考察對(duì)不同正常個(gè)體(n=6)尿液樣本，在該方法下色譜圖各組分保留時(shí)間保持一致。NE、E、DA、IP保留時(shí)間分別為3.4、4.6、7.8、19.5 min。

對(duì)正常人尿液，空白尿液，空白尿液+混合標(biāo)準(zhǔn)品+內(nèi)標(biāo)，嗜鉻細(xì)胞瘤患者尿液樣本按上述處理方法及色譜條件，取上清液20 μL進(jìn)樣，如圖B顯示NE、E、DA、IP保留時(shí)間處均無(wú)干擾。各色譜峰分離度均大于1.5，符合要求。不同樣本色譜圖見圖1。

2.7標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制于健康人空白尿液中分別精密加入NE、E、DA混合標(biāo)準(zhǔn)品系列工作液(濃度為15.625、125、250、500、1 000、2 000、4 000、8 000、10 000 μg·L-1)，按“2.5”項(xiàng)下操作。濃度相當(dāng)于1.5625、12.5、25、50、100、200、400、800、1 000 μg·L-1。最終以內(nèi)標(biāo)法定量，按“2.5”項(xiàng)下操作，均加入10 μg·L-1鹽酸異丙腎上腺素(內(nèi)標(biāo)貯備液)10 μL。以樣品峰面積對(duì)內(nèi)標(biāo)峰面積之比(R)為縱坐標(biāo)，NE、E、DA混合標(biāo)準(zhǔn)品系列工作液濃度(C)為橫坐標(biāo)，分別得方程RNE=0.011 3C+0.204 4，r=0.999 5;RE=0.0138C-0.0159，r=0.9997;RDA=0.019 9C+1.510 3，r=0.999 8。NE、E、DA在1.56～1 000 μg·L-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

注：A.正常人尿液對(duì)照；B.空白尿液對(duì)照；C.空白尿液+混合標(biāo)準(zhǔn)品+內(nèi)標(biāo)；D.嗜鉻細(xì)胞瘤患者樣本；1.NE；2.E；3.DA；4.IP；注：空白尿液的制備:按本文敘述氧化鋁吸附法，對(duì)同一份尿液反復(fù)吸附5次，除去尿液中本身含有的NE，E，DA作為空白尿液。

2.8回收率和精密度試驗(yàn)于1 mL空白尿液中分別精密加入NE、E、DA混合標(biāo)準(zhǔn)品系列工作液(濃度為125、1 000、8 000、10 000 μg·L-1)，按“2.5”項(xiàng)下操作。每個(gè)濃度各分別平行檢測(cè)(n=3)。三者的日內(nèi)及日間精密度的RSD均小于9.00%，三個(gè)濃度方法回收率在94.22%～108.69%之間，該方法符合生物樣品分析要求，結(jié)果見表1。

±s)

2.9穩(wěn)定性試驗(yàn)配制12.50、100.00和800.00 μg·L-1三個(gè)濃度的尿液樣品于-40℃冰箱中保存，反復(fù)凍融0次,1次,2次,3次，冷凍0、5、10、20、30 d后，按“2.5”項(xiàng)下處理，考察樣品在-40℃條件保存的穩(wěn)定性(n=5)，結(jié)果表明，樣品反復(fù)凍融3次、于-40℃冰箱中保存30 d仍能保持穩(wěn)定，RSD均小于10%，見表2。

2.10樣品測(cè)定本研究選取2013年3月至2014年2月于某三甲醫(yī)院因陣發(fā)性或持續(xù)性高血壓、心慌、頭痛、出汗等癥狀就診的患者為研究對(duì)象，收集24 h尿液，檢測(cè)NE、E、DA含量。其中發(fā)現(xiàn)NE顯著升高(正常人高值的2~5倍)者8例(男性5例，女性3例)，并經(jīng)術(shù)后病理檢查8例均確認(rèn)為嗜鉻細(xì)胞瘤，作為嗜鉻細(xì)胞瘤組；性別、年齡(年齡±3歲)匹配的高血壓且排除嗜鉻細(xì)胞瘤的患者160例,作為高血壓對(duì)照組；性別、年齡(年齡±3歲)匹配的正常人64例作為正常對(duì)照組。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)(所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件；P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，結(jié)果見表3。

表2　樣品反復(fù)凍融及30 d冷凍穩(wěn)定性試驗(yàn)

由表3可知，該方法用于嗜鉻細(xì)胞瘤的診斷，發(fā)現(xiàn)8例患者24 h尿液NE含量顯著高于正常人及非嗜鉻細(xì)胞瘤高血壓人群，診斷為嗜鉻細(xì)胞瘤，并經(jīng)病理檢查證實(shí)。該8例嗜鉻細(xì)胞瘤患者均屬于大量分泌NE的分泌類型，且都是單側(cè)腎上腺發(fā)病，瘤體平均大小為4.9 cm×4.6 cm×2.5 cm。術(shù)后第二天起24 h尿NE、E含量明顯下降，與正常組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，頭痛、心慌、嘔吐等癥狀消失，血壓恢復(fù)正常。

表3　各組24 h尿液NE、E、DA含量

注：★與正常對(duì)照組比較，P<0.05 ；△嗜鉻細(xì)胞瘤組與高血壓對(duì)照組比較，P<0.05。

3討論

3.1HPLC-FD檢測(cè)人體尿液兒茶酚胺方法學(xué)評(píng)價(jià)及注意事項(xiàng)本文建立的兒茶酚胺檢測(cè)方法的核心是HPLC-FD及經(jīng)典的氧化鋁吸附法。尿液樣品經(jīng)自制的活性氧化鋁吸附，通過簡(jiǎn)單的試劑(滅菌注射用水、甲醇)洗滌，鹽酸洗脫即可進(jìn)樣測(cè)定，與已報(bào)道的柱前衍生化、陽(yáng)離子萃取柱、液—質(zhì)聯(lián)用等檢測(cè)方法[8-9]相比，具有以下特點(diǎn)：操作過程簡(jiǎn)單、快速；所用試劑及材料經(jīng)濟(jì)易配備，成本低；樣本留取對(duì)患者無(wú)損傷。綜上得該方法適合基層醫(yī)院開展，臨床實(shí)用性強(qiáng)。

本文采用1 mol·L-1Tris(0.1%EDTA)緩沖液來提高活性氧化鋁的吸附能力，經(jīng)過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)緩沖液酸堿度(pH)在8.45～8.65范圍內(nèi)氧化鋁吸附效果良好，當(dāng)1 mol·L-1Tris(0.1%EDTA)緩沖液pH調(diào)制8.70及以上時(shí)NE、E、DA處均不出峰。很可能是因?yàn)閮翰璺影吩趐H≥8.70的堿性條件不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化成無(wú)熒光的其他產(chǎn)物。NE、E、DA結(jié)構(gòu)中均含有兩個(gè)酚羥基，對(duì)光、熱、堿、氧化劑均不穩(wěn)定，因此樣本收集時(shí)除需濃鹽酸防腐外還須低溫，避光放置。樣品處理及檢測(cè)等整個(gè)實(shí)驗(yàn)要連續(xù)、快速，操作過程盡量做到低溫、避強(qiáng)光照射。

3.2尿液兒茶酚胺含量測(cè)定在嗜鉻細(xì)胞瘤患者診斷中的重要作用兒茶酚胺類物質(zhì)屬于生物堿，既是細(xì)胞體內(nèi)非常重要的神經(jīng)遞質(zhì)，也是重要的激素物質(zhì)，在人體的心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌腺、腎臟等組織系統(tǒng)的生理活動(dòng)中起著廣泛的調(diào)節(jié)作用，直接影響人體的代謝水平。嗜鉻細(xì)胞瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤、高血壓、帕金森病、抑郁癥等都會(huì)導(dǎo)致兒茶酚胺類物質(zhì)的代謝異常。其中兒茶酚胺的檢測(cè)在嗜鉻細(xì)胞瘤的診斷中靈敏度及特異性極高[10]。而較之腦脊液、血液等生物樣品，尿液中兒茶酚胺較高，無(wú)需較高倍數(shù)的富集，只需去除樣品中的雜質(zhì)即可。本文所建立方法臨床適用性強(qiáng)，及時(shí)的檢測(cè)對(duì)嗜鉻細(xì)胞瘤患者的及早診斷，降低突發(fā)心血管意外事件的風(fēng)險(xiǎn)具有極其重要的意義，同時(shí)對(duì)兒茶酚胺代謝異常性疾病的診斷和致病機(jī)制的探究有指導(dǎo)作用。

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Determination of catecholamines concentrations in human urine

by high performance liquid chromatography-fluorimetric detection

CHENG Li-juan1, HUANG Yan2, XU Du-juan1,2,et al

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China; 2.DepartmentofPharmacy,

theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method based on high performance liquid chromatography-fluorimetric detection to determine the concentrations of catecholamines (norepinephrine, epinephrine and Dopamine) in human urine for diagnosis of pheochromocytoma.MethodsThe catecholamines in human urine samples were adsorbed by homemade activated alumina with Tris-buffer under alkaline conditions, using internal standard method for the determination of their concentrations. Separation was performed on a ZORBAX-SB (4.6 mm× 250 mm, 5 μm) colum. The mobile phase was consist of methanol-20 mmol·L-1potassium dihydrogen phosphate with flow rate of 0.8 mL·min-1, column temperature: 25 ℃. The fluorescence intensity was measured at the excitation wavelengths of 286 nm and the emission wavelengths of 318 nm.ResultsThe linear relationships were good within 1.56～1 000 μg·L-1for norepinephrine bitartrate, epinephrine hydrochloride, and dopamine hydrochloride (r=0.999 5, 0.999 7, 0.999 8); The intra-and inter-day coefficients of variation were between 0.31% and 8.02%; the mean analytical recoveries of high, medium and low concentrations were in the range of 94.22% to 108.69%.ConclusionThe method is accurate, stable, and shows wide linear range, which can provide a basis for the corresponding disease diagnosis and Perioperative treatment.

Key words:catecholamines; urine; high performance liquid chromatography-fluorimetric detection; activated alumina

(收稿日期：2014-03-11，修回稿：2014-07-09)

通信作者：許杜娟，女，主任藥師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤藥理學(xué)和臨床藥學(xué)，E-mail：Xudujuan6365@163.com

作者簡(jiǎn)介：成利娟，女，碩士研究生

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.016