治療性單克隆抗體類制品質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的思考

張峰 綜述 孟淑芳 審校

（中國(guó)食品藥品檢定研究院?jiǎn)慰寺】贵w產(chǎn)品室，北京100050）

治療性單克隆抗體類制品質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的思考

張峰 綜述 孟淑芳 審校

（中國(guó)食品藥品檢定研究院?jiǎn)慰寺】贵w產(chǎn)品室，北京100050）

治療性單克隆抗體制品在腫瘤、自身免疫、器官移植和感染性疾病的治療中均取得了顯著療效，其品種和市場(chǎng)份額逐年顯著提高。隨著新的治療性單克隆抗體制品的研發(fā)和上市，不同產(chǎn)品的質(zhì)量控制研究，特別是新技術(shù)在質(zhì)量控制中的應(yīng)用被提到新的高度。由于治療性單克隆抗體制品結(jié)構(gòu)和生產(chǎn)的復(fù)雜性，使得質(zhì)量控制的復(fù)雜程度也相應(yīng)提高。本文結(jié)合治療性單克隆抗體質(zhì)量控制的工作經(jīng)驗(yàn)和國(guó)際上的最新進(jìn)展，對(duì)治療性單克隆抗體質(zhì)量控制項(xiàng)目設(shè)定、標(biāo)準(zhǔn)和方法進(jìn)展進(jìn)行論述。

治療性單克隆抗體；質(zhì)量控制；方法；標(biāo)準(zhǔn)

1982年，重組人胰島素作為人類歷史上的第一種生物治療藥物被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng)，從此，重組生物制品開始逐步增多并在生物制品市場(chǎng)中占據(jù)越來(lái)越大的市場(chǎng)份額,特別是近年來(lái)單克隆抗體（以下簡(jiǎn)稱單抗）類藥物的發(fā)展，更受到業(yè)界的關(guān)注，越來(lái)越多的企業(yè)投入到單抗的開發(fā)和生產(chǎn)中來(lái)。同時(shí)，隨著一大批療效明確的單抗藥物專利即將到期，如：赫塞汀（曲妥珠單抗）、美羅華（利妥昔單抗）、愛必妥（西妥昔單抗）和類克（英利西單抗）等，許多醫(yī)藥企業(yè)通過生物仿制藥的方式加入到單抗制品的開發(fā)和生產(chǎn)中。隨之而來(lái)的問題是，由于缺乏對(duì)單抗結(jié)構(gòu)與其安全性和有效性間關(guān)系的深入了解，新加入企業(yè)和生物仿制藥企業(yè)在單抗制品的質(zhì)量控制方面往往通過模仿其他單抗質(zhì)量控制項(xiàng)目和方法的方式解決質(zhì)量控制問題，這種方式在確保實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制目標(biāo)方面存在一定的局限性。同時(shí)，一大批新技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用，極大地促進(jìn)了單抗質(zhì)量控制技術(shù)項(xiàng)目和方法的發(fā)展?，F(xiàn)結(jié)合工作經(jīng)驗(yàn)和對(duì)單抗質(zhì)量控制的理解對(duì)單抗質(zhì)量控制項(xiàng)目和方法的研究現(xiàn)狀進(jìn)行討論。

1 抗體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)介

抗體為通過鏈間二硫鍵連接的2條重鏈和2條輕鏈構(gòu)成的“Y”形結(jié)構(gòu)，重鏈和輕鏈通過鏈內(nèi)二硫鍵形成多個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中重鏈和輕鏈N端的第1個(gè)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列多變，被稱為可變區(qū)（VH和VL），二者為抗體同抗原結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。另外，重鏈和輕鏈分別有3個(gè)和1個(gè)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相對(duì)保守，被稱為恒定區(qū)（CH和 CL），重鏈的第2個(gè)恒定區(qū)（CH2）中存在1個(gè)N糖基化位點(diǎn)，該位點(diǎn)的糖基化對(duì)其發(fā)揮抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)具有重要作用[1-2]，同時(shí)該糖基化位點(diǎn)上連接的寡糖鏈的唾液酸化程度對(duì)于抗體穩(wěn)定性也存在重要影響[3]。重鏈第3個(gè)恒定區(qū)（CH3）介導(dǎo)抗體同F(xiàn)c受體和補(bǔ)體的結(jié)合，從而在抗體效應(yīng)的發(fā)揮和清除中發(fā)揮重要作用。不同的抗體由于其種類和亞類不同而在重鏈恒定區(qū)數(shù)目、附屬結(jié)構(gòu)和一些細(xì)微結(jié)構(gòu)中存在一定差異。

治療性單抗一般為人鼠嵌合、人源化或人源單抗，多為IgG1亞類，可根據(jù)其治療目的和作用機(jī)制選擇其他亞類，如IgG2a，并可在抗體基本結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上對(duì)抗體結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，如：為了消除抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)而在大腸桿菌中表達(dá)或突變CH2糖基化位點(diǎn)；為了消除補(bǔ)體激活效應(yīng)而采用單臂結(jié)構(gòu)或F（ab）2結(jié)構(gòu)；為了提高對(duì)低抗原表達(dá)量細(xì)胞的殺傷效應(yīng)而在單抗上偶聯(lián)細(xì)胞毒性藥物等[4]。由于抗體對(duì)應(yīng)不同的抗原特異性、其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、作用機(jī)制的多樣性以及生產(chǎn)工藝的復(fù)雜性都會(huì)影響抗體的質(zhì)量，因此需采用多種質(zhì)量控制項(xiàng)目和方法對(duì)單抗的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。單抗的質(zhì)量控制項(xiàng)目和方法選擇是在對(duì)抗體結(jié)構(gòu)與其安全性和有效性之間關(guān)系不斷深入了解的基礎(chǔ)上逐步發(fā)展的，同時(shí)，對(duì)方法的運(yùn)用和對(duì)結(jié)果的解釋也是在對(duì)分析方法的不斷發(fā)展和深入理解的基礎(chǔ)上而不斷深入和變更的一個(gè)動(dòng)態(tài)過程。

2 單抗制品的質(zhì)量控制項(xiàng)目及要求

單抗制品同其他生物制品的要求一致，質(zhì)量控制是貫穿終產(chǎn)品生產(chǎn)的全過程控制，從生產(chǎn)用起始材料或原材料的質(zhì)量控制至終產(chǎn)品的質(zhì)量控制，根據(jù)生產(chǎn)工藝的不同階段設(shè)置不同的質(zhì)量控制項(xiàng)目要求，本文主要討論單抗原液至終產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)要求。

總體上看，單抗的質(zhì)量控制項(xiàng)目（見表 1）主要包括一般項(xiàng)目、理化檢測(cè)、含量、鑒別、純度、活性、安全性等幾個(gè)方面[5]，其中安全性方面檢測(cè)包括：DNA殘留、宿主細(xì)胞蛋白殘留、生產(chǎn)過程相關(guān)外源因子和異常毒性檢測(cè)。作為對(duì)純化工藝去除外源因子能力的驗(yàn)證，宿主細(xì)胞DNA、宿主細(xì)胞蛋白殘留和生產(chǎn)過程相關(guān)外源因子的檢測(cè)主要在注冊(cè)階段的原液樣品中進(jìn)行，考慮到最適樣本的問題，這些項(xiàng)目在成品檢測(cè)中可以不檢測(cè)。在產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定和檢測(cè)方法選擇的過程中，應(yīng)根據(jù)制品的具體情況選擇合適的檢測(cè)方法，并根據(jù)工藝的穩(wěn)定性、產(chǎn)品的安全性和有效性以及方法本身的變異情況設(shè)定合適的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。由于對(duì)結(jié)構(gòu)與功能間關(guān)系認(rèn)識(shí)的不斷深入和檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，產(chǎn)品的檢定方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是一個(gè)不斷發(fā)展提高的過程，下面就當(dāng)前單抗制品的檢測(cè)方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行說明和論述。

3 單抗質(zhì)量方法研究現(xiàn)狀及其標(biāo)準(zhǔn)制定的注意事項(xiàng)

從表1可以看出，對(duì)于一個(gè)質(zhì)量控制項(xiàng)目可能會(huì)采用不同的方法，從不同的側(cè)面反映單抗的質(zhì)量，特別是近年來(lái)一些新技術(shù)應(yīng)用于單抗的質(zhì)量控制，對(duì)單抗制品的質(zhì)量控制提供了更高的保障。但同時(shí)也需考慮到，對(duì)于單抗，表1中所列出的項(xiàng)目只是一個(gè)較為普遍的原則，但并不是所有的檢測(cè)方法都適用于每一種單抗制品，表中所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)也并非適用于所有的制品，針對(duì)于某一個(gè)特定單抗來(lái)說，都會(huì)有一些特殊的因素需要考慮，下面就不同檢測(cè)方法在單抗質(zhì)量控制中的作用及其標(biāo)準(zhǔn)制定時(shí)需要考慮的問題作簡(jiǎn)單分析。

在一般檢測(cè)項(xiàng)目中的可見異物檢查中，要求應(yīng)無(wú)肉眼可見異物，但在一些特殊單抗制品中，由于其某些特征，如分子表面有大量疏水基團(tuán)或有游

離的半胱氨酸等，使其可能會(huì)形成肉眼可見的蛋白顆粒，這些制品使用時(shí)多采用在線濾器過濾的方式除去蛋白顆粒，在充分闡明顆粒性質(zhì)和有具體臨床研究資料的情況下，這類制品的可見異物項(xiàng)目檢查中可以容許有肉眼可見的顆粒樣物質(zhì)。

表1 單抗質(zhì)量控制項(xiàng)目及要求

含量測(cè)定中，除使用理化的分光光度法或Lowry法和二辛可酸 (bicinchoninic acid，BCA)法等外，還可使用免疫學(xué)的酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）法檢測(cè)。ELISA法中如果使用特異性抗原作結(jié)合單抗的物質(zhì)時(shí)，也可同時(shí)評(píng)價(jià)單抗的結(jié)合活性。同時(shí)通過比較免疫學(xué)方法和理化方法測(cè)定的蛋白含量，還可以獲得總蛋白中具有特異性結(jié)合活性的蛋白所占比例的相關(guān)信息，但是ELISA法測(cè)定單抗制品中單抗含量的過程中，需對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的含量和活性精確標(biāo)定，否則將使測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生較大的誤差。

純度檢測(cè)需結(jié)合高效液相色譜（HPLC）法和電泳法。HPLC法中，分子尺寸排阻高效液相色譜法（Size Exclusive Chromatography-HPLC，SECHPLC）側(cè)重于檢測(cè)單抗的單體、二聚體和多聚體含量百分比[8]。離子交換色譜法（Ion Exchange Chromatography，IEC）雖然主要用于根據(jù)電荷異質(zhì)性對(duì)樣品進(jìn)行鑒別檢測(cè)，但在某些單抗制品中，不同電荷異構(gòu)體的活性具有一定差異時(shí)，需引入離子交換高效液相色譜法（IEC-HPLC）進(jìn)行純度檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果中不同電荷異構(gòu)體的含量百分比予以限定[9-10]，以確保具有特定活性的電荷異構(gòu)體所占比例達(dá)到要求。電泳方法中包括：十二烷基硫酸鈉-毛細(xì)管電泳（Capillary Electrophoresis-Sodium Dodecyl Sulphate，CE-SDS）和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electropheresis，SDS-PAGE），主要用于檢測(cè)單抗碎片和純化過程中未去除的雜質(zhì)蛋白，二者通常選擇其中的一種即可。SDS-PAGE方法中，為確保靈敏度，可在使用靈敏度和分辨率更高的梯度膠的同時(shí)，在電泳中設(shè)置染色對(duì)照。由于CE-SDS檢測(cè)不需要對(duì)結(jié)果進(jìn)行二次處理，所以其結(jié)果較SDS-PAGE更加精確穩(wěn)定客觀，但受制于上樣量的限制，其對(duì)雜質(zhì)蛋白的檢測(cè)效率不高，在某些對(duì)純度要求較高的單抗制品中（如眼用溶液），可采用APTS（8-Aminopyren-1,3,6-trisulphonic Acid）熒光標(biāo)記后使用激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器的方法提高對(duì)雜質(zhì)蛋白的檢出效率[11-12]。

鑒別檢測(cè)中等電聚焦電泳（Isoelectroric Electrophoresis Focusing，IEF）、IEC-HPLC和肽圖方法均為較常用的鑒別方法，其中胰酶肽圖主要用于檢測(cè)產(chǎn)品中發(fā)生的脫氨基、甲硫氨酸氧化、C-末端封閉和錯(cuò)誤二硫鍵等結(jié)構(gòu)改變[10，13-14]；IECHPLC方法主要用于檢測(cè)樣品中不同電荷異構(gòu)體的比例。IEF法中，常規(guī)的水平等電聚焦電泳方法雖然較為常用，但是其結(jié)果受電泳條件和電泳膠的影響較大，雖然使用預(yù)制膠可以在一定程度上降低變異性，但其穩(wěn)定性仍然較毛細(xì)管等電聚焦電泳（Capillary Iso-Electric Focusing，CIEF）差，特別是在融合蛋白等高度糖基化的重組制品的檢測(cè)中表現(xiàn)更為明顯[15]。ICEF在可獲得較穩(wěn)定結(jié)果的同時(shí)，還可對(duì)不同電荷異構(gòu)體的含量進(jìn)行分析，其方法包括兩種，一種是傳統(tǒng)的將樣品在兩性電解質(zhì)中聚焦后，采用化學(xué)或物理學(xué)方法，使各聚焦條帶順序通過檢測(cè)窗口并進(jìn)行檢測(cè)的方法；另一種是在聚焦后，使用移動(dòng)檢測(cè)器對(duì)毛細(xì)管聚焦區(qū)域進(jìn)行掃描并檢測(cè)的方法，后者的結(jié)果穩(wěn)定性明顯高于前者[16]。另外，毛細(xì)管區(qū)帶電泳（Capillary Zone Electrophoresis，CZE）近年來(lái)也被用于單抗鑒別的方法，該方法通過蛋白分子的電荷異質(zhì)性進(jìn)行分離，通過對(duì)比樣品同參比品遷移時(shí)間的差異對(duì)樣品進(jìn)行鑒別。標(biāo)準(zhǔn)制定中規(guī)定遷移時(shí)間差異值應(yīng)位于一個(gè)確定的范圍內(nèi)，該差異范圍同使用的電泳方法的變異性相關(guān)，一般規(guī)定為應(yīng)小于0.1 min，且樣品同標(biāo)準(zhǔn)品混合后的電泳圖譜中應(yīng)只有1個(gè)主峰。使用ELISA和蛋白印跡 （Western-Blot）法進(jìn)行鑒別時(shí)，只有使用產(chǎn)品特異性的抗原/抗體時(shí)才具有鑒別作用，目前一般使用通用抗體，如：抗Fc抗體和抗IgG輕鏈抗體對(duì)樣品進(jìn)行鑒別，這種鑒別方法的結(jié)果更有利于對(duì)產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，而在對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行特異性鑒別方面的意義并不顯著。

單抗制品的活性檢測(cè)包括結(jié)合活性和生物學(xué)活性兩個(gè)方面，目前對(duì)于兩種活性評(píng)價(jià)方法的區(qū)分在于單抗結(jié)合靶抗原后是否引起生物學(xué)效應(yīng)并對(duì)該生物學(xué)效應(yīng)檢測(cè)，質(zhì)量控制中一般以同時(shí)包括兩個(gè)方面的測(cè)定為宜。結(jié)合活性的評(píng)價(jià)方法主要包括：ELISA法、流式細(xì)胞術(shù)法和表面等離子共振法；生物學(xué)活性的評(píng)價(jià)方法主要為細(xì)胞學(xué)方法，檢測(cè)單抗結(jié)合靶抗原后在靶細(xì)胞中引起的生物效應(yīng)，如：補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒效應(yīng)、抗體依賴的細(xì)胞毒效應(yīng)、靶細(xì)胞的增殖、增殖抑制、細(xì)胞裂解以及效應(yīng)細(xì)胞因子的產(chǎn)生等。如果生物學(xué)活性方法中設(shè)計(jì)了同配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合靶抗原的考察因素或單抗同靶抗原結(jié)合并發(fā)揮治療作用的過程中沒有或有很小競(jìng)爭(zhēng)性因素時(shí)，則質(zhì)量控制中可只評(píng)價(jià)單抗的生物學(xué)活性（如利妥昔單抗）。如單抗的治療機(jī)制中包括了同高親和力或高濃度的配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合靶抗原，而生物學(xué)活性方法中沒有設(shè)計(jì)檢測(cè)該競(jìng)爭(zhēng)因素對(duì)單抗發(fā)揮活性的影響時(shí)，必需評(píng)價(jià)單抗的結(jié)合活性，如抗CTLA-4單抗：由于CTLA-4同B7的親和力很高[17]，因此在生物學(xué)活性評(píng)價(jià)方法中沒有設(shè)定親和力考察因素的情況下，需使用3種方法評(píng)價(jià)單抗的結(jié)合活性：間接ELISA法比較樣品-參比品親和力、競(jìng)爭(zhēng)ELISA法評(píng)價(jià)其阻斷CTLA-4結(jié)合B7的能力、Biacore法測(cè)定親和系數(shù)。

對(duì)外源因子的檢測(cè)中，目前存在較多爭(zhēng)議和疑問的方面主要是DNA殘留方面。目前有3種用于檢測(cè)宿主細(xì)胞DNA殘留量的檢測(cè)方法：斑點(diǎn)雜交法、實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（Realtime-PCR）和閾值（Threshold）法。其中斑點(diǎn)雜交法對(duì)儀器和設(shè)備的需求最低，但是該方法操作復(fù)雜、結(jié)果重復(fù)性和可比性低且結(jié)果的判定存在一定的主觀性。目前市場(chǎng)上已經(jīng)有 Realtime-PCR檢測(cè)各種宿主細(xì)胞DNA殘留量的商業(yè)化試劑盒，檢出限可達(dá)fg級(jí)水平，其應(yīng)用逐步廣泛，但聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法存在易污染的缺點(diǎn)。Threshold法操作簡(jiǎn)便，可檢測(cè)到pg級(jí)的殘留DNA，但其靈敏度較上述兩種方法低，且其檢測(cè)試劑和設(shè)備昂貴，使其應(yīng)用受到限制。目前來(lái)說，最常用的方法為斑點(diǎn)雜交方法，但隨著Realtime-PCR法的推廣和應(yīng)用，可取代斑點(diǎn)雜交方法。

4 單抗質(zhì)量控制中的標(biāo)準(zhǔn)品和檢驗(yàn)需求

標(biāo)準(zhǔn)品是單抗質(zhì)量控制中的重要參考依據(jù)，尤其在鑒別項(xiàng)目、結(jié)構(gòu)分析和活性項(xiàng)目的檢定中是確定樣品的結(jié)構(gòu)和活性的參照物，而結(jié)構(gòu)和活性又是確保樣品安全性和有效性最重要的2個(gè)質(zhì)量控制參數(shù)，也就是說，標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)構(gòu)和活性在很大程度上代表了產(chǎn)品的安全性和有效性。初期的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)使用小量試制階段生產(chǎn)的產(chǎn)品制備，在臨床前安全性和有效性研究中對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，并將其活性參數(shù)和結(jié)構(gòu)特征同其安全性和有效性進(jìn)行初步聯(lián)系。最終的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)采用中間試制階段生產(chǎn)的臨床試驗(yàn)用批次的樣品制備，在隨后的臨床試驗(yàn)中對(duì)其安全性和有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)應(yīng)用可能的方法盡量闡明其活性參數(shù)和結(jié)構(gòu)特征，包括各級(jí)結(jié)構(gòu)、電荷異質(zhì)性、肽圖圖譜、翻譯后修飾等。同時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品制備后，應(yīng)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并在現(xiàn)有穩(wěn)定性數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定期再標(biāo)定，如在規(guī)定時(shí)間間隔內(nèi)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品中的純度進(jìn)行評(píng)價(jià)，包括：二聚體、多聚體和碎裂片段等的形成；對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)構(gòu)改變進(jìn)行評(píng)價(jià)，包括二硫鍵斷裂、氧化和末端賴氨酸環(huán)化等；對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的活性變化進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)其活性使用規(guī)定方法進(jìn)行再標(biāo)定。如需制備新批次的標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)在之前批次標(biāo)準(zhǔn)品的活性和結(jié)構(gòu)研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)新批次標(biāo)準(zhǔn)品的活性參數(shù)和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行詳細(xì)檢測(cè)，在最大程度上確保新制備批次的標(biāo)準(zhǔn)品同之前批次的標(biāo)準(zhǔn)品具有可比性。

單抗制品的檢驗(yàn)需求主要存在于新品種注冊(cè)和生產(chǎn)工藝的變更可能會(huì)使單抗的安全性和有效性產(chǎn)生改變的情況下，即生產(chǎn)工藝的變更可能對(duì)產(chǎn)品的序列、結(jié)構(gòu)、內(nèi)在均一性和各種結(jié)構(gòu)所占的比例等產(chǎn)生影響，最終對(duì)產(chǎn)品的治療效果和安全性產(chǎn)生影響。

5 未來(lái)可能引進(jìn)的單抗質(zhì)量控制項(xiàng)目和檢測(cè)方法

隨著對(duì)單抗結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的深入了解和臨床經(jīng)驗(yàn)的積累，一些新的質(zhì)量控制項(xiàng)目被引入單抗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。如前所述，糖基化修飾不僅在單抗發(fā)揮功能中起著重要的作用，還對(duì)單抗的穩(wěn)定性和免疫原性產(chǎn)生重要的影響[3，18]。但由于受制于缺乏簡(jiǎn)便有效的方法和對(duì)糖鏈結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的深刻認(rèn)識(shí)，將糖基化項(xiàng)目的檢測(cè)作為質(zhì)量控制項(xiàng)目的案例主要局限于部分在研究中明確糖基化對(duì)其功能具有明顯影響的制品中，檢測(cè)項(xiàng)目也主要在于唾液酸含量、糖基化程度和糖鏈構(gòu)成等方面，相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定局限于對(duì)量的限定上。免疫原性的評(píng)價(jià)理論上應(yīng)該也是一個(gè)重要的質(zhì)量控制項(xiàng)目?，F(xiàn)在的治療性單抗雖然進(jìn)行了人源化改造甚至為完全的人源抗體，但根據(jù)網(wǎng)絡(luò)學(xué)說[19]，仍具有免疫原性，即仍可在人體內(nèi)引起相應(yīng)的抗體產(chǎn)生，這就引起了兩個(gè)問題，即：誘導(dǎo)產(chǎn)生中和性抗體的速度會(huì)不會(huì)對(duì)單抗的療效產(chǎn)生明顯的影響，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體會(huì)不會(huì)同人體組織產(chǎn)生交叉反應(yīng)并形成病理性自身免疫性損傷？目前該項(xiàng)目的研究較少，而且對(duì)單抗免疫原性的評(píng)價(jià)主要在安全性評(píng)價(jià)階段進(jìn)行，在常規(guī)質(zhì)量控制中不適用。

在新的檢驗(yàn)方法中，毛細(xì)管電泳方法是近年被引入單抗質(zhì)量控制中的方法，而質(zhì)譜[20-21]、核磁共振[22]、分析型超速離心[23-24]和圓二色譜[25]等技術(shù)也在單抗質(zhì)量控制中開始展露頭腳。毛細(xì)管電泳方法可以替代多種傳統(tǒng)方式的電泳方法，如CE-SDS可替代傳統(tǒng)的SDS-PAGE；CIEF可替代傳統(tǒng)的水平等電聚焦電泳；而CZE可通過檢測(cè)單抗的電荷異質(zhì)性對(duì)單抗進(jìn)行精確鑒別，同時(shí)毛細(xì)管電泳方法還可用于N-連接寡糖和單糖的分析和檢測(cè)[26]，這些檢測(cè)方法均有商業(yè)化的試劑盒和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程供參考，結(jié)果穩(wěn)定性好且易于驗(yàn)證和標(biāo)準(zhǔn)化；質(zhì)譜檢測(cè)對(duì)結(jié)構(gòu)的解析具有高度的精確性，可有效地對(duì)單抗一級(jí)結(jié)構(gòu)和翻譯后修飾結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。特別是在肽圖檢測(cè)中，傳統(tǒng)的紫外檢測(cè)方法無(wú)法闡明每個(gè)特征峰的特征，對(duì)于多個(gè)肽段形成的單一峰也無(wú)法闡明其中組分，同時(shí)也無(wú)法對(duì)特征峰的變異和新峰的性質(zhì)及可能的形成原因進(jìn)行解釋，而質(zhì)譜檢測(cè)可為上述問題的解釋和解決提供重要的參考信息；雖然SEC-HPLC可檢測(cè)單抗中的二聚體和多聚體，但研究人員使用已經(jīng)形成大量肉眼可見顆粒的單抗樣品進(jìn)行SEC-HPLC檢測(cè)的結(jié)果中仍為單一峰，說明該方法對(duì)超高分子量的巨大多聚體檢測(cè)能力有限，而分析型超速離心克服了色譜方法的上述缺點(diǎn)，對(duì)多聚體的檢測(cè)效率得到很大程度的提高。核磁共振方法在克服了對(duì)大分子樣品檢測(cè)的限制后，可用于確定單抗的三維結(jié)構(gòu)，并對(duì)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行精確比較。圓二色譜方法則可對(duì)單抗的二級(jí)結(jié)構(gòu)和二硫鍵等進(jìn)行有效檢測(cè)。但是受儀器昂貴、操作復(fù)雜、結(jié)果分析難度高等因素的限制，質(zhì)譜、核磁共振和圓二色譜方法目前僅局限于研究階段，而在常規(guī)批次的檢定中不適用。

通過上述論述，當(dāng)前單抗質(zhì)量控制的重點(diǎn)在于為通過可比性檢測(cè)，確保單抗制品的安全性和有效性，檢測(cè)的范圍和方法將隨著對(duì)單抗的結(jié)構(gòu)同功能間關(guān)系的不斷深入理解而不斷加深。同時(shí)，新的檢測(cè)技術(shù)在單抗質(zhì)量控制研究中的應(yīng)用，也對(duì)進(jìn)一步提高單抗的質(zhì)量起到了重要作用。

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The Quality Control of Therapeutic Monoclonal Antibody Products

Zhang Feng/writing，Meng Shufang/proofreading（Division of Monoclonal Antibody Products of the National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

The curative effects of therapeutic monoclonal antibody products have been proved for the treatment of cancer，autoimmune diseases，transplantation and infectious diseases.The varieties and market share of therapeutic monoclonal antibody products have risen considerably year after year.Along with the development and marketing of new therapeutic monoclonal antibodies，more importance has been attached to the quality control of these products so as to ensure their quality.Because of the complexity of therapeutic monoclonal antibody products both in their structure and manufacturing，the quality controls of the products become more difficult.This article briefly reviewed the principle of standard establishment and methods for the quality control of therapeutic monoclonal antibody products based on the latest progress in the world and our working experience in the quality control of the products.

Therapeutic Monoclonal Antibody；Quality Control；Method；Specification

10.3969/j.issn.1672-5433.2013.01.006

2012-09-28）

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2009ZX09307-001）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2007AA021601，2007AA021204）

張峰，男，碩士，副主任技師。研究方向：治療性單克隆抗體的質(zhì)量控制。E-mail：zhf5122@sina.com