聚山梨醇酯80修飾H 102聚乳酸-羥基乙酸納米粒的腦靶向性研究及細(xì)胞毒性評價(jià)

譚遠(yuǎn)貞，邵夏炎,徐淑梅，張奇志

（1.天津醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，天津300070；2.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，上海201203）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease,AD）是一種以老年斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié)為特征的神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能不斷惡化，日常生活能力進(jìn)行性減退，并伴有各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙。前期大量實(shí)驗(yàn)研究表明H102肽是一個極具前景的治療AD新藥[1-2]。由于H102肽體內(nèi)穩(wěn)定性差，頻繁注射給藥會給老年患者帶來很大負(fù)擔(dān)，不利于臨床的應(yīng)用。目前，輸送蛋白多肽類藥物的納米釋藥系統(tǒng)得到較廣泛的研究，聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）是目前最為成功地應(yīng)用于藥物載體的生物可降解聚合物，但單純PLGA納米粒容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，而其表面經(jīng)聚乙二醇（PEG）修飾后能顯著地避開網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬從而在體內(nèi)達(dá)到長循環(huán)的作用[3]。由于胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制能夠介導(dǎo)納米粒載藥系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)入腦，而單純納米粒主要是起到防止藥物迅速被體內(nèi)酶降解及緩慢釋藥的作用，其誘導(dǎo)腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞的胞吞作用小，限制了藥物生物利用度的進(jìn)一步提高。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，經(jīng)聚山梨醇酯80修飾的納米粒能增加穿透血腦屏障入腦量[4]。王華芳等[5]對PLA納米粒示蹤標(biāo)記，證實(shí)了聚山梨醇酯80修飾的PLA納米粒具有穿透血腦屏障的特性，機(jī)制可能是毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用。為提高H102肽納米粒腦內(nèi)靶向性，本文在前期工作的基礎(chǔ)上，制備聚山梨醇酯80修飾H102聚乳酸-羥基乙酸納米粒，并進(jìn)行體內(nèi)腦靶向性研究和細(xì)胞毒性的安全性評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料 乙腈（色譜純，TEDIA Company，USA）；甲酸（色譜級，TEDIA，美國）；醋酸安普利肽（純度> 98.5%，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；H102肽納米粒（自制）；安捷倫液質(zhì)聯(lián)用儀(Agilent 1100series LC/MSD，美國)；氮吹儀(MD200-2，杭州奧盛儀器有限公司)；ICR小鼠（雄性，體質(zhì)量24～26g，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 色譜和質(zhì)譜條件 色譜柱：Agilent XDB C18（21mm×50mm，5μm），保護(hù)柱：Phenomenex C18（4.0mm×3.0mm，5mm），流動相：乙腈（0.1%甲酸）-水（0.1%甲酸）=14.5∶85.5，V/V，流速：0.4mL·min-1，柱溫：40℃。電噴霧離子源（ESI），正離子模式（SIM+），離子通道選擇：H102肽為[M-H]+，m/z 645.3；安普利肽為[M-H]+，m/z 843.2。毛細(xì)管電流：2000nA，離子源溫度：100℃，干燥氣流速：3.0L·min-1。

1.2.2 生物樣品處理 （1）血漿樣品：取血漿樣品100μL，加入10μL安普利肽溶液（內(nèi)標(biāo)，濃度2μg· mL-1）及300μL乙腈，渦漩2min，12000r·min-1、4℃離心15min，取上清液100μL氮?dú)獯蹈桑?00μL流動相復(fù)溶后，離心、取上清液10μL LC-MS進(jìn)樣分析。（2）腦組織樣品：按照1:2重量比加入0.1%甲酸水，進(jìn)行冰水浴勻漿。將勻漿液于4000r·min-1、4℃離心3min，取上清液150mL加入10mL內(nèi)標(biāo)及300mL乙腈，渦旋2min，12000r·min-1、4℃離心15min，取上清液300μL氮?dú)獯蹈?，?0μL流動相復(fù)溶后，離心、取上清液10μL LC-MS進(jìn)樣分析。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 （1）血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密移取500μg·mL-1H102肽儲備液，稀釋成100、40、20、10、4、2、1和0.4μg·mL-1工作液，取以上濃度H102肽50μL，加入50μL空白血漿，使H102肽終濃度為 50、20、10、5、2、1、0.5和 0.2μg·mL-1，按“1.2.2”項(xiàng)下方法處理，LC/MS測定。(2)腦勻漿液標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密移取500μg·mL-1H102肽儲備液，稀釋成300、150、75、37.5、18.75和9.375ng·mL-1工作液，取以上濃度H102肽50μL，加入100μL空白腦勻漿液，使H102肽終濃度為100、50、25、12.5、6.25和3.125ng·mL-1，按“1.2.2”項(xiàng)下方法處理，LC/ MS測定。

1.2.4 方法回收率和精密度 分別配制含低、中、高3個濃度的血漿和腦勻漿液H102肽樣品溶液各5份，按“1.2.2”項(xiàng)下方法處理，在1d內(nèi)測完，之后每天各濃度配制1份樣品，連續(xù)測定5d，考察精密度。分別配制含低、中、高3個濃度的對照樣品，即加入相應(yīng)體積的超純水稀釋成相應(yīng)的濃度，按“1.2.2”項(xiàng)下方法處理，LC/MS測定。記錄峰面積，以兩者的比值計(jì)算回收率。

1.2.5 動物實(shí)驗(yàn) 取ICR小鼠48只，隨機(jī)分成2組，分別按照H102肽的給藥劑量為4mg·kg-1尾靜脈注射H102-NP（注射前用0.9%生理鹽水分散）和PS-H102-NP溶液（注射前用1%聚山梨醇酯80分散）。于給藥后5、15、30、45、60和120min眼眶取血并心臟灌流分離腦組織，每時(shí)間點(diǎn)重復(fù)做4只小鼠，樣品按“1.2.2”項(xiàng)下方法處理后置-20℃冷凍保存，48h內(nèi)測定。

1.2.6 細(xì)胞毒性評價(jià) 取對數(shù)生長期的BCECs細(xì)胞，胰酶消化并吹打?yàn)榧?xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整懸液細(xì)胞濃度為1×105/mL，取100μL細(xì)胞懸液接種到96孔板，置37℃，5%CO2的孵箱中培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)液。HBSS洗兩遍后分別加入以下用無血清DMEM配制的聚山梨醇酯80（polysorbate 80，PS）：16%、8%、4%、2%和1%；單純納米粒：12.5、25、50和 100mg·mL-1；含 1%聚山梨醇酯 80（polysorbate 80,PS）納米粒：12.5、25、50和100mg· mL-1。每組設(shè)定6個復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔和陰性對照孔。分別孵育4、24h后，去掉培養(yǎng)液，加100μL MTT（1.25mg·mL-1）繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸掉上清，每孔加入150μL二甲基亞砜，低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀492nm處測量各孔的吸光值。根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間差異采用t檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 （1）血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線：以H102肽和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值R為縱坐標(biāo)，H102肽濃度C為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=15.654x-14.78，r=0.9989，表明H102肽濃度在0.2～50μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。（2）腦勻漿液標(biāo)準(zhǔn)曲線：以H102肽和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值R為縱坐標(biāo)，H102肽濃度C為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y= 0.0233x-0.0062，r=0.9997，表明H102肽濃度在0.3125～100ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 方法回收率和精密度 血漿中低、中、高3個濃度的回收率分別為89.2%、91.1%和84.2%，日內(nèi)和日間的精密度均小于4.4%。腦勻漿液中低、中、高3個濃度的回收率分別為90.2%、92.5%和87.6%，日內(nèi)和日間的精密度均小于5.3%。

2.3 藥時(shí)曲線 H102-NP和PS-H102-NP小鼠靜脈注射后，H102肽在血和腦組織中的藥－時(shí)曲線見 圖1。

圖1 小鼠尾靜脈注射H102-NP和PS-H102-NP后在血漿和腦組織中的藥－時(shí)曲線Fig 1 Concentration-time curves of H102in plasma and brain after intravenous injection of H102-NP and PS-H102-NP in mice

由圖1可知，靜脈注射H102-NP和PS-H102-NP后，腦組織中H102肽的濃度均在30min達(dá)峰，且在45min時(shí)仍維持較高的濃度。在相同時(shí)間點(diǎn)里，后者腦組織中的H102肽的濃度都較前者高。采用藥動學(xué)軟件DAS2.0對藥物濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，H102-NP和PS-H102-NP在血漿和腦組織中的藥動學(xué)參數(shù)見表1?？梢姡琍S-H102-NP在腦內(nèi)的半衰期和滯留時(shí)間都延長，清除率下降，AUC值是H102-NP的1.42倍，表明PS-H102-NP具有較佳的腦靶向性。

表1 小鼠尾靜脈注射H102-NP和PS-H102-NP后在血漿和腦內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)Tab 1 Pharmacokinetic parameters of plasma and brain after intravenous injection of H102-NP and PS-H102-NP in mice

2.4 細(xì)胞毒性評價(jià) 不同濃度的聚山梨醇酯80和納米粒分別作用于BCECs細(xì)胞4h和24h后，細(xì)胞的存活力情況見圖2、3。

圖2 不同濃度聚山梨醇酯80對細(xì)胞活力的影響Fig 2 Cell viability of various concentration of polysorbate 80on BCECs

圖3 不同濃度H102-NP和PS-H102-NP對細(xì)胞活力的影響Fig 3 Cell viability of various concentration of H102-NP and PS-H102-NP on BCECs

由圖2可知，不同濃度聚山梨醇酯80孵育2h后，8%以上時(shí)對細(xì)胞有一定的毒性，而濃度在4%以下時(shí)細(xì)胞活力仍有80%以上，而孵育24h后，4%的濃度顯示出了較大的毒性，細(xì)胞活力下降到23%，而2%濃度對細(xì)胞毒性仍很小，細(xì)胞的活力仍達(dá)90%，故濃度為2%以下的聚山梨醇酯80具有較佳的安全性。由圖3可知，H102-NP和PS-H102-NP孵育4h后，細(xì)胞活力均隨濃度的增加有所下降，但細(xì)胞活力仍在80%以上，具有較低的毒性，兩者的差異（P>0.05）不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在孵育24h后，濃度為12.5mg·mL-1H102-NP組和PS-H102-NP組細(xì)胞活力仍有80%以上，毒性較低，兩者的差異（P>0.05）不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而25mg·mL-1和50mg·mL-1H102-NP組的細(xì)胞活力均降到70%左右，而對應(yīng)濃度的PS-H102-NP組細(xì)胞的活力仍有80%以上，兩者的差異（P<0.05）具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明長時(shí)間孵育后，H102-NP對細(xì)胞表現(xiàn)出一定的毒性，而PS-H102-NP仍具有較佳的安全性。

3 討論

藥動學(xué)研究結(jié)果表明，PS-H102-NP能增加藥物的入腦量，其在腦內(nèi)的半衰期和滯留時(shí)間延長，清除率下降，且其AUC值是H102-NP的1.42倍，表明PS-H102-NP具有良好的腦靶向性。BCECs細(xì)胞是模擬血腦屏障的腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞模型，納米粒透血腦屏障的機(jī)制可能是通過細(xì)胞的胞吞作用。細(xì)胞毒性結(jié)果表明，聚山梨醇酯80具有較好的安全性，且經(jīng)其包衣的PS-H102-NP對細(xì)胞的毒性較未包衣的H102-NP小，表明PS-H102-NP具有較佳的安全性，其入腦量的增加不是通過破壞血腦屏障的途徑而增加的。低密度脂蛋白受體是納米粒被腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞攝取的重要因素，PS-H102-NP在體內(nèi)可能會與血漿中的載脂蛋白結(jié)合，而被低密度脂蛋白受體識別攝取入腦[6]。本實(shí)驗(yàn)研制的PSH102-NP具有良好的腦靶向性和低毒性，為該劑型應(yīng)用于阿爾茨海默病的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)對需要腦靶向治療的藥物劑型開發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。

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