紫紅笛鯛線粒體全序列與笛鯛屬魚類分化年代的貝葉斯分析

廖 杰, 王中鐸, 郭昱嵩, 劉楚吾

(廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 南海水產(chǎn)經(jīng)濟動物增養(yǎng)殖廣東普通高校重點實驗室, 廣東 湛江 524025)

紫紅笛鯛線粒體全序列與笛鯛屬魚類分化年代的貝葉斯分析

廖 杰, 王中鐸, 郭昱嵩, 劉楚吾

(廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 南海水產(chǎn)經(jīng)濟動物增養(yǎng)殖廣東普通高校重點實驗室, 廣東 湛江 524025)

利用常規(guī) PCR未純化產(chǎn)物直接測序的方法, 獲得紫紅笛鯛(Lutjanus argentimaculatus)全長為16 543 bp線粒體DNA全序列, GenBank登錄號為JN182927。結(jié)合GenBank中的已有數(shù)據(jù)比較分析表明: 紫紅笛鯛與笛鯛屬(Lutjanus)線粒體基因組成基本一致, 符合脊椎動物的特征, 各基因間進化速率差異顯著; 13個蛋白編碼基因拼接序列貝葉斯建樹的后驗率顯著高于單基因或全序列, 更適用于笛鯛屬的貝葉斯法系統(tǒng)分化分析和年代推斷; 13個蛋白編碼基因及其拼接序列進行的系統(tǒng)進化分析均支持紫紅笛鯛與勒氏笛鯛(Lutjanus russellii)及海雞母笛鯛(Lutjanus rivulatus)親緣關(guān)系較近; 基于13個蛋白編碼基因拼接序列的貝葉斯松散分子鐘推算出笛鯛屬魚類兩個主要支系大約在 61.5Ma前古新世的達寧階與蒙蒂階交界時期發(fā)生分化。

紫紅笛鯛(Lutjanus argentimaculatus); 線粒體全序列; 貝葉斯分析; 松散分子鐘; 笛鯛屬魚類

紫紅笛鯛(Lutjanus argentimaculatus)隸屬硬骨魚綱(Osteichthyes), 鱸形目(Perciformes), 笛鯛科(Lutjanidae), 笛鯛屬(Lutjanus)。主要分布于印度洋和太平洋中部及西部, 包括中國的南海和東海南部, 是一種優(yōu)質(zhì)的食用魚類。有關(guān)紫紅笛鯛的研究很多, 涉及人工養(yǎng)殖、種群遺傳多樣性以及它在笛鯛屬中的關(guān)系等多個方面。邢玉娜等[1]、區(qū)又君等[2]分別研究了紫紅笛鯛育苗和幼魚養(yǎng)殖密度與攝食關(guān)系; 張俊彬等[3]研究了中國南海部分地區(qū)紫紅笛鯛養(yǎng)殖和野生群體的遺傳多樣性。Russell等[4]綜述了澳大利亞紫紅笛鯛生態(tài)特征、群體遺傳結(jié)構(gòu)以及養(yǎng)殖技術(shù), 并記錄紫紅笛鯛存在獨特的生活史:幼魚和早期成魚都可以生活在淡水溪流中。Guo等[5]基于線粒體基因(COX2和Cytb)的系統(tǒng)進化表明紫紅笛鯛與紅鰭笛鯛(Lutjanus erythopterus)關(guān)系密切;王中鐸等[6]綜合利用3個線粒體基因(COX1、COX2和Cytb)和2個核基因(RAG1和RAG2)構(gòu)建了笛鯛屬魚類的系統(tǒng)進化樹, 揭示出紫紅笛鯛在進化上最早與大體型、紅體色、近岸底棲的紅鰭笛鯛和千年笛鯛(Lutjanus sebae)一支分化, 獨立于其他笛鯛屬魚類, 自成一支。

近年來發(fā)展起來的貝葉斯模型參數(shù)可直接進行量化,并以后驗概率來表示各分支的可信度而不需用自引導(dǎo)法(Bootstrap)進行檢驗, 而且在計算速度和可靠性上明顯優(yōu)于其他算法, 十分利于線粒體全序列等較大數(shù)據(jù)集的分析[7-8]。 另外, 貝葉斯松散分子鐘利用化石標定點計算分化時間, 推測出實驗對象出現(xiàn)或發(fā)生年代已經(jīng)引起魚類進化研究者的廣泛重視[9-11]。隨著測序技術(shù)的進步使線粒體全序列的獲得變得越來越容易, 用線粒體全序列作為遺傳進化分析的材料, 將會獲得更加全面的信息進而得到更合理的結(jié)論, 這一技術(shù)在魚類進化研究中的應(yīng)用越來越廣泛[12-14]。一直以來對笛鯛屬魚類的分類學(xué)地位和形態(tài)分類學(xué)標準都存在爭議[6,11,13]。Guo等[5-6]利用線粒體基因(COX2和Cytb)和核基因重建了笛鯛屬的系統(tǒng)進化歷程, 并且先后獲取了多種笛鯛屬魚類的線粒體DNA(mtDNA)全序列。

本研究通過測定紫紅笛鯛全序列進而確定該物種在笛鯛屬的分類地位, 并通過貝葉斯分析推斷笛鯛屬各支系的分化年代同時分析比較線粒體全序列及其各編碼區(qū)段貝葉斯建樹的優(yōu)劣性, 為揭示魚類演化研究積累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和總DNA的提取

紫紅笛鯛0.8 kg, 性腺發(fā)育未成熟, 購自湛江市霞山區(qū)水產(chǎn)品交易市場。采用形態(tài)與DNA 條碼結(jié)合的方法鑒定實驗對象[14], 參照盧圣棟等[15]的方法從肌肉或鰭條中提取樣本DNA, 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 LA-PCR純化線粒體DNA

引物參考王中鐸等[10](表 1), 均由上海 Sangon生物技術(shù)公司合成。采用長距 PCR(LA-PC R)引物L(fēng)A1和LA2擴增得到覆蓋整個線粒體DNA序列的大片段, PCR反應(yīng)體系為: 總體積25 μL, 含1×PCR LA Buffer, dNTPs 15 nmol, 引物各 20 pmol, LATaqDNA聚合酶(TaKaRa) 2.5U, 總DNA 約20 ng。擴增條件: 94 ℃預(yù)變性1 min; 98℃變性10 s, 68℃退火16 min, 循環(huán)30次; 最后72℃延伸10 min。1%的瓊脂糖電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測。

1.3 常規(guī)PCR擴增獲取線粒體DNA片段

以稀釋20倍的LA-PCR 產(chǎn)物為模板, 使用表1所列常規(guī)PCR引物擴增獲取長度600～1 000 bp左右的相互重疊的小片段。反應(yīng)體系為: 總體積50 μL, 含1×PCR Buffer, dNTPs 10 nmol, 引物各20 pmol, rTaqDNA聚合酶(TaKaRa) 2.5 U, DNA約20 ng。PCR 反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為: 94 ℃預(yù)變性3 min, 94 ℃變性42 s, 50～55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸55 s, 共30個循環(huán), 最終72 ℃延伸10 min, 用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物, 凝膠成像儀拍照。PCR擴增產(chǎn)物委托廣州華大基因公司進行序列雙向測定。

1.4 全序列拼接與分析

用Invitrogen軟件包的ContigExpress進行序列拼接, 利用Editseq程序(http://www.dnastar. com/)查找序列進行開放閱讀框, 獲得序列互補鏈以及統(tǒng)計各密碼子所占比例; 利用 MEGA 4.0 軟件完成蛋白編碼序列的翻譯和氨基酸編碼情況的調(diào)查[16]; 在線查找tRNA (http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE)[17];用 Sequin 軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Sequin/ index.html)遞交序列至 GenBank。從 GenBank下載的其余7種笛鯛的線粒體全序列(6種為本研究室測定)。分別利用ATPase6、Cytb、COX1、COX2、ND1、ND2、ND4、ND5等基因以及D-loop區(qū)進行遺傳距離分析。

1.5 基于線粒體全序列和編碼基因及其拼接序列的貝葉斯分析

參考Drummond等[18]的方法利用Beast 1.6.1軟件包(http://beast.bio.ed.ac.uk/)構(gòu)建貝葉斯樹, 并利用貝葉斯松散分子鐘(uncorrected relaxed lognormal clock)推斷分化年代[19]。軟件運行設(shè)置如下: (GTR+G+I+relaxed, MCMC=1000000, burn in=1000)利用 FigTree v1.3.1(http://tree.bio.ed.ac.uk/)生成樹圖。所選的外群物種為斑馬魚(Danio rerio)和青鳉(Oryzias latipes), 化 石 標 定 點 則 為 鲀 科(Tetraodontidae)魚類紅鰭東方豚(Takifugu rubripes)和凹鼻鲀(Tetraodon nigroviridis), 它們的分化上下限為56.0 ～32.25 Ma[20]。

1.6 不同基因貝葉斯后驗概率分析

分別建立全序列、13個蛋白編碼基因及其拼接序列的貝葉斯分析樹, 以笛鯛主分支, 紫紅笛鯛所在支以及所有分支平均貝葉斯后驗概率最為判斷各基因和拼接序列貝葉斯建樹的優(yōu)劣性。

2 實驗結(jié)果

2.1 片段擴增、序列拼接及分析

LA-PCR獲得的長距產(chǎn)物(圖1)為模板進行常規(guī)PCR(圖2), 擴增產(chǎn)物直接測序后拼接獲得16 543 bp的紫紅笛鯛線粒體全序列。序列中(A、T、C、G)4種堿基分別占 28.25%, 24.68%, 30.95%, 16.12%, A+T＞G+C。用Sequin上傳至Gene Bank, 登錄號為JN182927。紫紅笛鯛mtDNA基因組包括13個蛋白編碼基因, 22個tRNA基因, 2個rRNA基因和1個控制區(qū)?；蚍植汲什痪恍? 其中輕鏈(L-strand)僅編碼8個tRNA基因(Pro、Glu、Ser、Tyr、Cys、Asn、Ala、Gln)及ND6基因, 其余基因皆由重鏈(H-strand)編碼。

2.2 與已有笛鯛線粒體全序列的比較分析

分析得到紫紅笛鯛與7種笛鯛的ATPase6、Cyt b、COX 1、COX 2、ND 1、ND 2、ND 4、ND 5、D-loop和線粒體全序列的遺傳距離(表 2)。從表中可見, 單基因的物種間遺傳距離平均值為線粒體全序列間的1.4～1.9倍?；诨蚱嗡玫腒2P遺傳距離平均值比較可以看出: 紫紅笛鯛與馬拉巴笛鯛(Lutjanus malabarius)、紅鰭笛鯛和千年笛鯛的距離較遠(≥0.239), 而與其他笛鯛相對較近(≤0.195); 其中在

表1 線粒體DNA基因組序列測定引物Tab. 1 PCR primers for mtDNA complete genome

ATPase6間的遺傳距離比較中紫紅笛鯛與其他 4種笛鯛的遺傳距離值比其他基因片段的大, 而線粒體全序列間遺傳距離比較的結(jié)果與 12個基因片段的相似,均為馬拉巴笛鯛、紅鰭笛鯛和千年笛鯛的遺傳距離較遠。所有基因中海雞母笛鯛(L. rivulatus)的距離都最小,它相對其他笛鯛與紫紅笛鯛的關(guān)系更為密切。

圖1 LA-PCR電泳檢測圖Fig. 1 Electrophoresis of LA-PCR

圖2 部分常規(guī)PCR電泳檢測圖Fig. 2 Electrophoresis of common PCR

2.3 基于貝葉斯松散分子鐘的笛鯛分化年代推斷分析

分別建立 8種笛鯛線粒體全序列、線粒體各個編碼基因以及線粒體COX1基因的貝葉斯分析樹,得到多個貝葉斯推斷圖(圖3～圖5)。3圖中標定化石鲀科(Tetraodontidae)種都落在化石記錄范圍的中心。基于線粒體全序列的推斷結(jié)果顯示笛鯛屬的分化年代處于40.86Ma, 而基于13個蛋白編碼基因拼接序列的分析則顯示分化發(fā)生在 61.49Ma, 兩者推斷的主分支年代差異很大。圖 3中個小分支發(fā)生都位于32.7～8.2Ma這個相對較短的時間, 而圖 4中各小分支的出現(xiàn)年代跨度則小得多(57.8～48.7Ma)。兩個系統(tǒng)進化樹中8種笛鯛都可以明確的劃分成兩個支系。進化樹和遺傳距離各自的比較結(jié)果相吻合。遺傳距離較遠的紅鰭笛鯛, 馬拉巴笛鯛和千年笛鯛聚為一支, 紫紅笛鯛所在一支的另五種笛鯛聚為另一支。

表2 K2P紫紅笛鯛與7種笛鯛各基因區(qū)段遺傳距離比較Tab. 2 K2P Genetic distances between Lutjanus argentimaculatus and other snappers

在 3個圖中紫紅笛鯛所處的位置存在差異, 基于線粒體全序列的貝葉斯進化樹笛鯛分支不夠細致,而另外兩個圖中各個小支明顯分開。圖3和圖5中紫紅笛鯛和海雞母笛鯛(Lutjanus rivulatus)關(guān)系較緊密, 圖4中紫紅笛鯛和勒氏笛鯛(Lutjanus russellii)先聚為一支再和海雞母笛鯛并列。

線粒體DNA全序列、13個基因拼接序列以及單獨的基因序列建立貝葉斯分析樹, 笛鯛主分支、紫紅笛鯛分支以及平均后驗概率統(tǒng)計如表 3所示?；趍tDNA蛋白編碼基因拼接序列的貝葉斯分析, 無論是各支還是總后驗概率上都是最高點, 而基于線粒體全序列貝葉斯分析樹的各支后驗概率都很低。不同 mtDNA蛋白編碼基因得出的后驗概率差別很大,COX1、ND2、ATPase6總后驗概率最高,ND3、ND4、ND4L、COX3中等,ND1、ND5、ND6、COX2、Cytb、ATPase8較差,COX1、ND2、ATPase63個基因的拼接序列后驗概率也相對較高。紫紅笛鯛所在支的后驗概率在0.9以上的有ND2、ND3、ND4L樹圖均顯示紫紅笛鯛和勒氏笛鯛聚為一小支, 這和13個mtDNA蛋白編碼基因拼接序列聚類一致。

圖3 笛鯛線粒體全序列貝葉斯樹圖Fig. 3 Bayesian evolutionary tree of Mitochondrial complete sequence

圖4 線粒體蛋白編碼序列基因貝葉斯樹Fig. 4 Bayesian evolutionary tree of Mitochondrial protein coding gene

圖5 笛鯛屬魚類COX 1基因全序列貝葉斯樹Fig. 5 Bayesian evolutionary tree of COX 1 complete sequences of snappers

表3 線粒體DNA部分區(qū)段貝葉斯后驗概率Tab. 3 Bayesian posterior probability of mtDNA partial genes region

3 分析與討論

本研究基于獲取的紫紅笛鯛 mtDNA全序列和已存在的笛鯛mtDNA全序列, 探討了適用于貝葉斯系統(tǒng)進化分析的最佳序列, 明確了紫紅笛鯛與其他7種笛鯛的進化關(guān)系, 并推斷了笛鯛兩大支系的分化年代。

3.1 線粒體DNA全序列的高效獲取與分析

相比以直接提取獲得的總DNA為模板, 運用長距PCR的方法獲得紫紅笛鯛線粒體DNA長距片段,保證了總DNA很少量時模板量足夠使用, 同時提高了模板質(zhì)量, 采用常規(guī) PCR產(chǎn)物直接送測, 測序結(jié)果分析簡便, 整個周期短[10,12]。此方法可方便、快速獲得高質(zhì)量的線粒體全序列。之前對笛鯛魚類研究一般常用 MEGA進行建樹分析[6,24], 這種方式只能獲得物種間的進化關(guān)系, 不能獲得分化年代方面的結(jié)果。本研究嘗試運用BEAST 軟件對笛鯛全序列、mtDNA編碼區(qū)基因、mtDNA編碼區(qū)基因拼接數(shù)據(jù)集進行了貝葉斯分析, 并采用松散分子鐘模型推斷分歧的發(fā)生時間[21], 與MrBayes相比[22], BEAST操作直觀, 而且配套有 Figtree程序, 數(shù)據(jù)分析參數(shù)可進行及時調(diào)整, 生成的進化樹和進化年代可進行方便地編輯和標記。

3.2 基于貝葉斯法的最佳 mtDNA區(qū)段選擇

對進化關(guān)系研究時線粒體基因組 DNA及其 13個編碼基因的適用性, 以往研究者已經(jīng)進行了一系列基于NJ等傳統(tǒng)方法的分析。Zardoya等[23]比較了不同基因區(qū)分脊椎動物門下的各綱的能力, 認為COX1、Cytb、ND2、ND4、ND5都非常適合綱之間進化研究; 陳姝君等[24]比較了硬骨魚類目間不同基因的適應(yīng)性, 認為COX1、COX3、ND4、ND5最為出色; 郭昱嵩[25]則認為COX 2、ND 6最為適合鱸形目各屬間進化分析。王中鐸[6]對笛鯛屬的研究揭示出Cytb、COX1、COX2是最適合系統(tǒng)進化分析的單基因, 13個蛋白編碼基因拼接得到組合片段建立的NJ樹的置信度比單個基因有顯著提高, 但低于線粒體全序列?？梢? 基于分類階元不同, 區(qū)段的適用性存在差異。

本研究運用貝葉斯法分析了笛鯛屬系統(tǒng)發(fā)生,平均后驗概率的高低次序為: 13個蛋白編碼基因拼接序列(0.97)＞COX1＋ND2＋ATPase6(0.92)＞COX1、ND2、ATPase6、ND3和COX3(0.91～0.86)＞全序列(0.83)＞余下 8個單基因(0.82～0.59)。這與王中鐸等NJ法進行系統(tǒng)進化分析時的最佳線粒體區(qū)段存在差異, 同時他的研究的結(jié)果表明全序列會優(yōu)于任一編碼區(qū)。全序列的貝葉斯后驗率明顯低于13個蛋白編碼基因拼接序列, 甚至低于COX1、ND2、ATPase6等基因, 以 13個蛋白編碼基因拼接序列進行貝葉斯法年代推斷比全序列更可信。

3.3 笛鯛屬分化年代的貝葉斯法推斷

本研究通過紫紅笛鯛和各種笛鯛遺傳距離比較分析及貝葉斯進化樹分析表明, 雖然紫紅笛鯛在形態(tài)上屬于大型笛鯛種, 但是其生活史表現(xiàn)出特殊性[4]。表2中K2P遺傳距離統(tǒng)計顯示紫紅笛鯛和另外3種大型笛鯛(馬拉巴笛鯛、千年笛鯛、紅鰭笛鯛)遺傳距離較遠, 而與勒氏笛鯛、海雞母笛鯛較近。貝葉斯樹圖更直觀地表明這種關(guān)系。

Bruno等[26]研究發(fā)現(xiàn)貝葉斯法推斷系統(tǒng)發(fā)育往往會高估節(jié)點的后驗概率, 認為只有后驗概率大于95%的節(jié)點才是可信的?；谌蛄泻筒煌虻姆治鲋懈髦У暮篁灨怕识嘉催_到這一標準, 基于 13個蛋白編碼基因拼接的貝葉斯分析中各個節(jié)點的后驗率均大于95%, 支持紫紅笛鯛與勒氏笛鯛聚類。基于mtDNA的13個編碼區(qū)拼接序列, 貝葉斯松散分子鐘推測笛鯛屬兩大類群的分化年代距今約在61.5Ma年左右, 根據(jù)世界地質(zhì)年代表記錄這一時期處于古新世期間(65～53 Ma)的達寧階與蒙蒂階交界時期。

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(本文編輯: 譚雪靜)

Complete mitochondria sequence ofLutjanus argentimaculatusand Bayesian analysis

LIAO Jie, WANG Zhong-duo, GUO Yu-song, LIU Chu-wu

(Fisheries College, Key Laboratory of Aquaculture in South China Sea for Aquatic Economic Animal of Guangdong Higher Education Institutes, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524025, China)

Dec.,30,2011

Lutjanus argentimaculatus; mitochondrion genome; bayesian analysis; uncorrected relaxed lognormal clock; snapper fish

We got 16 543 bp Red snapper (Lutjanus argentimaculatus) complete mitochondrial DNA sequence through common PCR, with the GenBank registration number being JN182927. Our sequence and the data in Gen-Bank, red snapper’s mitochondrion gene composition were consistent with other snappers, according to the characteristics of vertebrates. Bayesian tree of complete sequence and 13 protein-coding genes and their splicing sequence indicated that: red snapper was close toL. russelliiandL. rivulatus. The evolution rate differences of different mitochondrial sections were obvious.COX1,ND2 andATPase6 Bayesian posterior rates were significantly higher than the other ten in 13 protein-coding mitochondrial genes of. The 13 protein-coding gene splicing sequences Bayesian posterior rates were significantly higher than completed sequence, and were more suitable for Bayesian uncorrected relaxed lognormal clock analysis. Thirteen protein coding gene splicing sequence’s Bayesian uncorrected relaxed lognormal clock work out snappers’ two main branches broke out in 61.5 Ma before, which was the junction point of Danian and Selandian in Paleocene.

Q349

A

1000-3096(2013)01-0062-08

2011-12-30;

2012-04-06

國家自然科學(xué)基金項目(31101904, 31201996); 廣東省自然科學(xué)基金項目(10452408801004224)

廖杰(1986-), 男, 湖南湘潭人, 碩士, 主要從事海洋生物研究工作, 電話: 13809887920, E-mail: liaojie05102@163.com;王中鐸,

, 電話: 13659795480, E-mail: aduofa@gmail.com