泥蚶初級(jí)卵母細(xì)胞發(fā)育及卵黃發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)研究

顧海龍, 林志華, 沈偉良, 陳彩芳

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306; 2. 浙江萬(wàn)里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院, 浙江 寧波 315100;3. 寧波市海洋與漁業(yè)研究院, 浙江 寧波 315100)

灘涂貝類養(yǎng)殖在我國(guó)有著悠久的歷史, 已成為我國(guó)海水養(yǎng)殖業(yè)的一個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn)。我國(guó)海岸線漫長(zhǎng), 沿海灘涂面積約 200萬(wàn) ha, 發(fā)展灘涂貝類養(yǎng)殖空間十分廣闊。但近年來(lái), 由于爛采酷捕, 再加上環(huán)境污染,致使灘涂貝類天然資源日趨衰竭, 因此, 需大力開(kāi)展灘涂貝類的人工增養(yǎng)殖。而目前, 國(guó)內(nèi)外關(guān)于灘涂貝類繁殖生物學(xué)方面的研究資料很少[1-3]。

在雙殼貝類的卵子發(fā)生中, 除卵原細(xì)胞期外,其他各期細(xì)胞均屬初級(jí)卵母細(xì)胞階段。此階段為卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)時(shí)期, 在此時(shí)期, 卵子的各個(gè)不同的發(fā)育階段, 主要的區(qū)分標(biāo)志是卵黃顆粒的形成[4]。然而至今, 對(duì)初級(jí)卵母細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程分期尚未形成統(tǒng)一定論, 但基本大同小異, 大致可分為卵黃合成前期、卵黃合成期及卵黃合成后期[1,5-7]。

泥蚶(Tegillarca granosa)是我國(guó)重要的傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)貝類之一, 是東南沿海地區(qū)的主要灘涂增養(yǎng)殖對(duì)象。近年來(lái)對(duì)于泥蚶的研究報(bào)道較多, 但主要集中在遺傳育種[8-10]、免疫學(xué)[11-13]和生態(tài)毒理學(xué)[14-16]等方面,而與繁殖相關(guān)的生殖細(xì)胞生物學(xué)研究?jī)H見(jiàn)泥蚶精子超微結(jié)構(gòu)的報(bào)道[17]。本文利用透射電鏡對(duì)泥蚶初級(jí)卵母細(xì)胞發(fā)育及其卵黃發(fā)生過(guò)程進(jìn)行了觀察研究,以期進(jìn)一步豐富泥蚶的繁殖發(fā)育生物學(xué)基礎(chǔ)理論。

1 材料與方法

1.1 材料

泥蚶采自浙江省寧波市甬盛水產(chǎn)種業(yè)有限公司,分別于2011年6月、7月及8月采樣3次, 此時(shí)泥蚶正處于繁殖期, 每次取 10只泥蚶, 解剖得到其卵巢。將卵巢一分為二, 一部分用于做組織切片觀察,進(jìn)行性腺各發(fā)育期的鑒定; 另一部分用于進(jìn)行電鏡觀察。

1.2 方法

利用組織切片觀察, 獲得性腺發(fā)育期處于間期、增殖期、生長(zhǎng)期和成熟期的卵巢樣品, 將其相應(yīng)的另一部分卵巢組織用 2.5%戊二醛固定后, 用 1%鋨酸進(jìn)行二次固定, 乙醇系列脫水, Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋, RMC POWER-TOME XL 超薄切片機(jī)切片, 醋酸鈾檸檬酸鉛雙重染色, 日立 H-7650型透射電鏡觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 卵母細(xì)胞發(fā)育分期

根據(jù)透射電鏡觀察到的各時(shí)期卵巢樣品中卵母細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器的變化和卵黃粒的形成與否, 將泥蚶卵母細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程分成三個(gè)時(shí)期, 分別為卵黃合成前期、卵黃合成期、卵黃合成后期。

2.1.1 卵黃合成前期

此期卵母細(xì)胞形狀不規(guī)則, 胞體表面呈現(xiàn)大量的微絨毛(圖1-1,MV)。胞內(nèi)細(xì)胞器較少, 細(xì)胞核多呈球形或橢球形(圖 1-3,N), 一部分卵母細(xì)胞的細(xì)胞核形狀開(kāi)始發(fā)生變化, 細(xì)胞核形成“偽足”狀外凸(圖1-2,箭頭示)。染色質(zhì)聚集成塊分布于核基質(zhì)中(圖1-3)。細(xì)胞中線粒體較多, 呈圓形或橢圓形(圖1-3,M)。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不發(fā)達(dá), 其上布滿核糖體(圖1-4,RER), 周圍分布少量的囊泡。高爾基復(fù)合體很少且不發(fā)達(dá)(圖 1-4,G)。胞內(nèi)溶酶體豐富, 并存在少量電子密度較高的卵黃物質(zhì)(圖1-4,箭頭示)。質(zhì)膜向內(nèi)凹陷(圖 1-5,箭頭示)。

2.1.2 卵黃合成期

泥蚶卵黃合成時(shí)期, 卵母細(xì)胞大量合成卵黃物質(zhì)。細(xì)胞體積變大, 仍為不規(guī)則形狀。細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)有大量小泡(圖1-6,MP)。細(xì)胞核發(fā)生變化較大, 核膜向內(nèi)凹陷, 內(nèi)陷處的電子密度較高(圖 1-5,雙箭頭示)。細(xì)胞邊緣出現(xiàn)少量脂滴(圖1-6,L)。細(xì)胞中出現(xiàn)很多卵黃粒(圖 1-7,Y)。線粒體數(shù)量明顯增加, 一部分線粒體開(kāi)始膨大、泡化, 內(nèi)部嵴消失(圖 1-8,箭頭示), 另一部分則保持原狀(圖1-8,M)。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)非常發(fā)達(dá), 片層很多, 可分為片層狀(圖 1-8,RER)和重疊的環(huán)狀(圖1-9,RER)兩種形態(tài)。高爾基復(fù)合體增多,其兩端膨大、分離、融合形成大量的高爾基體囊泡分布于胞質(zhì)中(圖1-10,GV)。

2.1.3 卵黃合成后期

卵黃形成后期, 卵母細(xì)胞發(fā)育成熟, 細(xì)胞體積達(dá)到最大。細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量較多, 內(nèi)部嵴不甚發(fā)達(dá),電子密度較低(圖1-11, M)。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不發(fā)達(dá), 多為單層(圖版 1-11, RER)。高爾基復(fù)合體不發(fā)達(dá)(圖1-11,G)。形態(tài)各異的卵黃粒分布于整個(gè)卵母細(xì)胞(圖1-11,Y)。

2.2 卵黃粒的來(lái)源

電鏡觀察發(fā)現(xiàn), 泥蚶卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中, 線粒體、高爾基體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、微吞飲泡等都參與了卵黃的發(fā)生和卵黃粒的形成。

2.2.1 線粒體

卵黃發(fā)生過(guò)程中, 散布于細(xì)胞質(zhì)中的一部分線粒體外膜皺褶, 體積膨脹、泡化, 內(nèi)部只殘余少量短嵴, 隨后高電子密度的卵黃物質(zhì)沉積于其中并逐漸充滿整個(gè)線粒體, 形成卵黃粒(圖1-12,MY)。線粒體演變成的卵黃粒初期仍具有線粒體的雙層膜特征,外膜呈波浪狀。

2.2.2 高爾基復(fù)合體

泥蚶卵黃發(fā)生時(shí), 高爾基復(fù)合體數(shù)量增多, 其扁平囊末端膨大、分離形成小泡, 小泡隨即互相融合形成高爾基體囊泡。胞質(zhì)內(nèi)的脂類和蛋白質(zhì)在高爾基體囊泡內(nèi)沉積、濃縮并最終演變?yōu)槁腰S粒(圖1-10,GVY)。

2.2.3 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

卵黃發(fā)生期間, 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)很發(fā)達(dá), 一部分仍保持片層狀結(jié)構(gòu), 表面布滿核糖體, 另一部分則呈多層重疊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。片層狀的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)兩端膨大形成小囊泡, 小囊泡互相融合形成大泡, 卵黃物質(zhì)在其內(nèi)沉積形成卵黃粒(圖1-13,Y); 環(huán)狀的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)則包繞在線粒體、脂滴等物質(zhì)周圍形成卵黃粒(圖 1-14,箭頭示)。

2.2.4 微吞飲泡

微吞飲泡也是卵黃粒的來(lái)源之一。卵黃發(fā)生時(shí),質(zhì)膜內(nèi)陷, 形成吞飲泡, 隨著卵黃物質(zhì)在其內(nèi)沉積,吞飲泡逐漸成為電子密度較高的卵黃粒(圖 1-6,MPY)。

3 討論

3.1 泥蚶卵黃發(fā)生的特點(diǎn)

泥蚶初級(jí)卵母細(xì)胞卵黃發(fā)生期間, 大多數(shù)細(xì)胞器的數(shù)量和形態(tài)都發(fā)生了明顯的變化。卵黃合成前期, 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量較少, 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器均不甚發(fā)達(dá)。隨著卵黃合成的進(jìn)行, 線粒體等細(xì)胞器明顯增多, 質(zhì)膜內(nèi)部出現(xiàn)大量的微吞飲泡,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體等片層增加, 它們都以各自的形式參與著卵黃粒的形成。到卵黃形成后期, 細(xì)胞器數(shù)量急劇減少, 大量的卵黃粒充滿整個(gè)細(xì)胞, 卵母細(xì)胞發(fā)育成熟。由此可見(jiàn), 本研究發(fā)現(xiàn)泥蚶卵黃發(fā)生期間細(xì)胞內(nèi)部的一系列變化與其他軟體動(dòng)物的研究結(jié)果基本一致[1-3,5-6,18-25]。

線粒體直接轉(zhuǎn)變?yōu)槁腰S粒的現(xiàn)象自從被 Favard等在扁卷螺(Planor bis)中發(fā)現(xiàn)[22]后, 已在文蛤(Meretrix meretrix)[1]、縊蟶(Sinonovacula constricta)[2]、太平洋牡蠣(Crassostrea giga)[5]等多個(gè)物種中得到論證。泥蚶卵黃發(fā)生過(guò)程中也存在這一現(xiàn)象, 上官步敏等將線粒體分為Ⅰ型和Ⅱ型兩種[2], 本實(shí)驗(yàn)中觀察到泥蚶卵母細(xì)胞內(nèi)參與卵黃顆粒形成的線粒體多為球狀或橢球狀的Ⅱ型(圖1-3,M)。

圖1 卵母細(xì)胞發(fā)育的組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)觀察Fig. 1 Histology and ultrastructure observation of oocyte development

眾學(xué)者對(duì)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與卵黃粒形成的方式所持觀點(diǎn)較多, 概括起來(lái)可分為兩種: 一種是呈環(huán)狀包繞在線粒體、脂滴、小囊泡或卵黃顆粒周圍形成卵黃粒; 另一種是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)兩端膨大形成小囊泡, 小囊泡互相融合形成大泡, 卵黃物質(zhì)在大泡內(nèi)沉積形成卵黃粒。各物種的觀察結(jié)果不盡相同: 文蛤[1]、縊蟶[2]、青蛤[3]、太平洋牡蠣[5]、櫛孔扇貝[23]中兩種形式均有; 貽貝[18,24]、僧帽牡蠣[21]、皺紋盤鮑[25]中只存在第一種形式; 墨西哥灣扇貝[6]只存在第二種形式。在泥蚶中的觀察結(jié)果與大多數(shù)貝類相同, 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以兩種形式參與卵黃粒的形成。

高爾基體在卵黃形成的過(guò)程中也較活躍, 與其他物種一樣, 泥蚶卵母細(xì)胞中的高爾基體主要以分離成大量的高爾基液泡的形式來(lái)形成卵黃粒。高爾基體是對(duì)細(xì)胞分泌物進(jìn)行最后加工和包裝的細(xì)胞器,這可能是高爾基體在卵黃合成前期數(shù)量很少, 而后期相對(duì)較多的主要原因。

與其他參與卵黃粒形成的細(xì)胞器相比, 線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的作用更為明顯。卵黃發(fā)生期間, 線粒體的數(shù)目急劇增加, 且大部分的線粒體內(nèi)部嵴逐漸溶解消失, 形成卵黃粒; 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度發(fā)達(dá), 到卵黃合成后期, 細(xì)胞內(nèi)仍可見(jiàn)相當(dāng)數(shù)量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)潴泡。因此, 我們認(rèn)為, 線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是泥蚶卵黃發(fā)生過(guò)程中形成卵黃粒的主要胞器。

3.2 卵黃發(fā)生的物質(zhì)來(lái)源

眾所周知, 卵黃發(fā)生的物質(zhì)來(lái)源分為內(nèi)源性和外源性兩種[26]。卵黃發(fā)生期間卵母細(xì)胞內(nèi)的卵黃物質(zhì)非常豐富, 這顯然是內(nèi)源性和外源性兩種途徑共同作用獲得的。

內(nèi)源性卵黃發(fā)生主要由線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及其他細(xì)胞器完成。外源性卵黃發(fā)生則依靠卵母細(xì)胞表面的受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用[27], 將卵母細(xì)胞外的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)送至卵母細(xì)胞內(nèi), 為卵黃的發(fā)生提供原料。隨著發(fā)育的進(jìn)行, 卵母細(xì)胞逐漸脫離濾泡細(xì)胞, 僅通過(guò)橋粒結(jié)構(gòu)與濾泡細(xì)胞相連[28]。本研究中卵母細(xì)胞表面產(chǎn)生大量的微絨毛, 電鏡下的微絨毛橫截面管腔清晰可見(jiàn)(圖 1), 且微絨毛伸入濾泡細(xì)胞內(nèi), 其基部膨大, 周圍聚集大量的糖原顆粒(圖 1-1,gl), 通過(guò)微絨毛管腔以吞飲泡的形式進(jìn)入卵母細(xì)胞。濾泡細(xì)胞雖然通過(guò)這種方式參與了卵黃的發(fā)生, 但它數(shù)量少、體積小并且卵黃發(fā)生期間的自身變化不大, 這都決定了它作為外源性原料的局限性。泥蚶與其他雙殼貝類一樣[1,5,29], 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要貯存于消化腺, 生殖期間, 性腺緊緊包繞在消化腺的周圍, 而腸道組織穿過(guò)性腺, 且解剖泥蚶時(shí)發(fā)現(xiàn), 性腺越好的泥蚶消化腺相對(duì)越小。所以, 作者認(rèn)為泥蚶卵黃發(fā)生時(shí)期外源性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要來(lái)源于消化腺。

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