KLF6在口腔癌細(xì)胞惡性生長(zhǎng)中的作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

劉圓月 侯菊花 李燦

[摘要]目的探討KLF6在口腔癌細(xì)胞惡性生長(zhǎng)中的作用機(jī)制。方法應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)95例口腔鱗癌組織和95例正?？谇火つそM織中KLF6、p21和cyclinD1的表達(dá)。結(jié)果KLF6、p21，和cyclinD1在口腔鱗癌與正常口腔黏膜組織之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；KLF6與p21的表達(dá)存在正相關(guān)，與cyclinD1表達(dá)存在負(fù)相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論KLF6基因在口腔鱗癌的發(fā)生起著作用，KLF6與組織分化的關(guān)系提示漿表達(dá)的KLF6可用于判定腫瘤患者預(yù)后，而p21和cyclinD1可能是作用的兩個(gè)靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞]KLF6；口腔癌細(xì)胞；作用機(jī)制；實(shí)驗(yàn)研究

[中圖分類(lèi)號(hào)]R78 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1674-4721（2012）12（a）-0092-02

在世界范圍，口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）為一種常見(jiàn)的口腔癌[1]，盡管醫(yī)療技術(shù)取得了巨大進(jìn)步，但口腔癌的預(yù)后仍然不夠理想。最近研究表明，癌發(fā)病的過(guò)程包括細(xì)胞增殖加速，細(xì)胞凋亡減弱，凋亡失敗等。KLF6是普遍表達(dá)的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，它與生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化及生長(zhǎng)相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成等都有關(guān)。本文旨在研究KLF6是否與口腔癌的發(fā)生相關(guān)，并探究其與p21和cyclinD1蛋白的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料

從本院2009年12月～2012年4月口腔鱗狀細(xì)胞癌患者中，隨機(jī)選95例作研究組，男65例，女30例，年齡37～75歲，平均52.8歲；術(shù)前均未經(jīng)任何放、化療等治療；其中，舌39例，口底27例，牙齦9例，頰13例，硬腭7例；臨床分期：Ⅰ期39例，Ⅱ期27例，Ⅲ期15例，Ⅳ期14例；頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者32例，無(wú)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者63例。取每例標(biāo)本腫瘤邊緣5mm外的癌旁正?？谇火つ?5例（均未見(jiàn)腫瘤組織）為對(duì)照，其中，舌39例，口底27例，牙齦9例，頰13例，硬腭7例。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1主要試劑與染色方法 兔抗人cyclinD1單克隆抗體購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)有限公司，鼠抗人p21蛋白單克隆抗體，多克隆兔抗KLF6均購(gòu)自SantaCruz公司。以上病理組織標(biāo)本均經(jīng)甲醛溶液固定、石蠟包埋，制成4μm厚切片。進(jìn)行免疫組織染色，以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.2結(jié)果判斷 在高倍鏡下對(duì)著色反應(yīng)作如下評(píng)分：無(wú)著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽(yáng)性范圍：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～100%為3分；兩項(xiàng)結(jié)果相加，0～1分為陰性（-）、2～7分為陽(yáng)性（+）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1KLF6、p21、cyclinD1在口腔癌組與對(duì)照組的表達(dá)

KLF6蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞漿均有呈黃色或棕色表達(dá)；p21及cyclinD1蛋白主要在細(xì)胞核呈現(xiàn)黃色或棕色表達(dá)，cyclinD1在口腔癌組的陽(yáng)性表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P<0.05），而KLF6、p21在對(duì)照組的陽(yáng)性表達(dá)高于口腔癌組（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2KLF6，p21，cyclinD1與口腔鱗癌臨床病理學(xué)關(guān)系

KLF6在不同組織分化組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；但KLF6在不同年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；p21在不同組織分化組表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；但p21在不同年齡、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。cyclinD1在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，臨床分期組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而在不同年齡、組織分化組的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。

2.3KLF6、p21、cyclinD1三者表達(dá)的相關(guān)性

KLF6與p21的表達(dá)存在正相關(guān)，與cyclinD1表達(dá)存在負(fù)相關(guān)（P<0.05），見(jiàn)表3。

3討論

研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)腫瘤細(xì)胞都存在一些細(xì)胞周期調(diào)控因子的表達(dá)異常，哺乳動(dòng)物細(xì)胞分裂及分化的主要調(diào)節(jié)事件發(fā)生在G1期，G1期周期蛋白異常表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞周期失調(diào)，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[2]。

p21屬于細(xì)胞周期依賴(lài)激酶抑制物，主要通過(guò)阻止視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（Rb）基因的磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子E2F的活性。當(dāng)Rb基因處于磷酸化狀態(tài)時(shí)，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)展的一些關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄不可以被E2F激活。以此，p21阻止了G1期向S期的過(guò)渡，將細(xì)胞周期阻滯在G1～S期，從而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。蔡楊等[3]推測(cè)p21基因失活是口腔癌發(fā)生過(guò)程中的早期分子事件。cyclinD1也被認(rèn)為是在細(xì)胞周期蛋白家族中限制G1期向S期轉(zhuǎn)化中重要的調(diào)控因子之一。該基因的擴(kuò)增、染色體重排或轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)都可導(dǎo)致其蛋白的過(guò)表達(dá)而發(fā)生癌變，cyclinD1的N端的序列可與Rb結(jié)合，在CDK4的協(xié)助下，使Rb蛋白被磷酸化，總之，cyclinD1的基因擴(kuò)增和過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致高磷酸化的Rb，從而促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞周期，使細(xì)胞持續(xù)增殖導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化[4]，因此，p21與cyclinD1均是口腔癌發(fā)生的關(guān)鍵蛋白。

有研究[5-6]報(bào)道KLF6與前列腺癌、肝癌的發(fā)生有密切關(guān)系。KLF6主要通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖以及促凋亡發(fā)生作用，除此外它的表達(dá)還與體內(nèi)一氧化氮的合成相關(guān)，可使細(xì)胞內(nèi)源性一氧化氮合酶的mRNA的表達(dá)增加3～4倍，TGF-β1和TGF-βⅠ、Ⅱ型受體以及HSP47、誘生型一氧化氮合酶等也是KLF6的靶基因。這些靶點(diǎn)都可以參與機(jī)體的細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)行為[7-8]，以上均說(shuō)明KLF6對(duì)腫瘤的抑制功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KLF6與口腔癌相關(guān)?？谇话㎏LF6的表達(dá)高于對(duì)照組，且隨著細(xì)胞分化程度降低，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)以及細(xì)胞惡性程度增加，異常的KLF6大量增加出現(xiàn)在細(xì)胞漿中，提示漿表達(dá)的KLF6可作為判定腫瘤惡性程度的指標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性可增加KLF6基因選擇性剪切的發(fā)生，產(chǎn)生的變異體如KLF6-SV1及KLF6-SV2等可影響p21的表達(dá)，因此在胞質(zhì)中競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)錄輔助因子或隔離野生型KLF6，以此對(duì)抗野生型KLF6對(duì)生長(zhǎng)的抑制，SirachE等[9]研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞株中，KLF6通過(guò)p21阻止Rb基因磷酸化，下調(diào)細(xì)胞周期蛋白cyclinD1，從而干擾細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，使腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制，本次研究發(fā)現(xiàn)的惡性腫瘤中KLF6基因核表達(dá)缺失或減弱與p21表達(dá)下調(diào)呈顯著正相關(guān)，正常組織KLF6表達(dá)cyclinD1表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)也支持以上結(jié)論。因此，筆者推測(cè)KLF6的功能是通過(guò)上調(diào)p21蛋白的表達(dá)及對(duì)cyclinD1的抑制而發(fā)揮作用?？傊?，KLF6與口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，p21及cyclinD1可能是KLF6作用的其中兩個(gè)靶點(diǎn)，具體機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 曾賀，顏雨春.1847口腔頜面部腫瘤構(gòu)成比分析[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，40（2）：186-188.

[2] 鄒向陽(yáng)，李連宏.細(xì)胞周期調(diào)控與腫瘤[J].國(guó)際遺傳學(xué)雜志，2006，29（1）：70-73.

[3] 蔡揚(yáng)，何園，盧虹，等.口腔鱗狀細(xì)胞癌cyclinE及p21waf1蛋白定量檢測(cè)及意義[J].中國(guó)腫瘤臨床，2008，35（3）：142-144.

[4] 張迎春，周士東，孔慶兗，等.p21和CyclinD1在肺癌組織中的表達(dá)及相互關(guān)系[J].徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，23（5）：395-398.

[5] 王鳳瑋，朱思偉，姚嬙，等.KLF6基因在前列腺癌中突變的研究[J].中華腫瘤防治雜志，2007，14（20）：1559-1562.

[6] 李霞，周宇.核轉(zhuǎn)錄因子KLF6在肝纖維化和肝癌發(fā)病中的作用研究進(jìn)展[J].實(shí)用肝臟病雜志，2009，12（5）：396-399.

[7] GehranRC，DAstolfoDS，PrietoC，etal.GenomicorganizationandfunctionalanalysisoftheGeneencodingtheKruppel-liketranscriptionfactorKLF6[J].BiochimBiophysActa，2005，1730（2）：137-146.

[8] TarabishR，ZahediK，MishraJ，etal.InductionofZf9inthekidneyfollowingearlyischemia／reperfusion[J].KidneyInt，2005，68（4）：1511-1519.

[9] SirachE，BureauC，PeronJM，etal.KLF6transcriptionfactorprotectshepatocellularcarcinoma-derivedcellsfromapoptosis[J].CellDeathDiffer，2007，14（6）：1202-1210.

（收稿日期：2012-07-13 本文編輯：林利利）