伊洛馬司他聯(lián)合卡培他濱對(duì)人喉癌hep-2細(xì)胞的影響＊

李 黎，張少容，熊輝強(qiáng)，高樹峰，蘭 寧

（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 330006）

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一類Zn2＋依賴的蛋白水解酶，參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解與組織重塑，可降解基底膜從而促進(jìn)喉癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。伊洛馬司他是羥肟家族中一種有效的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（matrix metallo-proteinase inhibitors，MMPI），其與存在于所有蛋白酶中的Zn原子的活性中心相結(jié)合，從而抑制MMP的活性，進(jìn)一步抑制喉癌的侵襲與轉(zhuǎn)移［1-2］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)伊洛馬司他、化療藥物卡培他濱兩藥單獨(dú)和聯(lián)合處理喉癌hep-2細(xì)胞，觀察其對(duì)hep-2細(xì)胞的影響，并探討伊洛馬司他在抗腫瘤過(guò)程中的具體作用機(jī)制，為喉癌的聯(lián)合化療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）試劑：RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；胰酶，北京索萊寶科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；MTT購(gòu)自Sigma公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；PI／annexinV凋亡盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；卡培他濱，大連美倫醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；伊洛馬司他購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。（2）細(xì)胞株：人喉癌細(xì)胞株hep-2，購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。將細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，其中青霉素、鏈霉素各100μ／mL，長(zhǎng)滿后用0.25%胰酶消化傳代。（3）引物：根據(jù)prime 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由金斯瑞生物科技有限公司合成。MMP-9引物（362bp）的上游序列為5′-CGG CAC CTC TAT GGT CCT C-3′，下游序列為 5′-CAC TTG TCG GCG ATA AGG AA-3′。內(nèi)參引物β-actin（434bp）上游序列為5′-CGG GAA ATC GTG CGT GAC-3′，下游序列為5′-TGG AAG GTG GAC AGC GAG G-3′。

1.2 甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測(cè)hep-2細(xì)胞的抑制率 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hep-2細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為7.5×104／mL接種于96孔細(xì)胞板，每孔100μL，待細(xì)胞貼壁后加藥。伊洛馬司他單獨(dú)作用組給予含伊洛馬司他濃度分別為2.5、5、10、20、40μg／mL的培養(yǎng)液100μL；卡培他濱單獨(dú)作用組給予含卡培他濱濃度分別為50、100、200、400、800μg／mL的培養(yǎng)液100μL，同時(shí)設(shè)立DMSO的陰性對(duì)照組、1640培養(yǎng)基空白對(duì)照組。每組每個(gè)濃度下設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h后，每孔加入20μL的 MTT（5mg／mL），孵育4h后，棄上清液，加入DMSO，終止反應(yīng)。微振蕩5min后，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490 nm處測(cè)吸光度（A）。以上各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。抑制率（%）＝（1-治療組A值／對(duì)照組A值）×100%。用SPSS13.0軟件求出IC10及IC50值。

MTT聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)選用兩個(gè)濃度組：（1）兩種藥物的IC10濃度組（即8μg／mL伊洛馬司他＋100μg／mL卡培他濱），該濃度組細(xì)分為3組，伊洛馬司他＋卡培他濱聯(lián)合濃度（8＋0）μg／mL組、伊洛馬司他＋卡培他濱聯(lián)合濃度（100＋0）μg／mL組，伊洛馬司他＋卡培他濱聯(lián)合濃度（8＋100）μg／mL組。（2）2種藥物較接近半數(shù)抑制度（IC50）且小于IC50的濃度組（40 μg／mL伊洛馬司他＋400μg／mL卡培他濱），同（1）中方法細(xì)分為3組。實(shí)驗(yàn)方法同前計(jì)算出各組的抑制率。采用Q值判斷伊洛馬司他和卡培他濱聯(lián)合用藥的性質(zhì)。Q＝Ea＋b／（Ea＋Eb-Ea＊Eb）。公式中Ea代表單藥A的抑制率，Eb代表單藥B的抑制率，Ea＋b代表兩藥聯(lián)用的抑制率。Q＞1.15為兩藥協(xié)同作用，0.85≤Q≤1.15為相加作用，Q＜0.85為拮抗作用。實(shí)驗(yàn)測(cè)得的IC10供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)hep-2細(xì)胞 MMP-9mRNA表達(dá)的變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hep-2細(xì)胞，以每孔5×104的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞鋪滿后加藥，分為4組：（1）伊洛馬司他組（8μg／mL）；（2）卡培他濱組（100μg／mL）；（3）聯(lián)合用藥組（8μg／mL伊洛馬司他＋100μg／mL卡培他濱）；（4）對(duì)照組（未用藥）。培養(yǎng)24后棄上清液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌兩遍，按Trizol試劑盒操作說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，并對(duì)RNA定量測(cè)定。取4μg總RNA為模板，按HiFi-MMLV cDNA第1鏈合成試劑盒操作說(shuō)明書操作，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以3μL cDNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃變性45s，60.5℃退火60s，72 ℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)Bandleader軟件分析各條帶，以目的基因熒光亮度／β-actin熒光亮度表示PCR產(chǎn)物含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)hep-2細(xì)胞的凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hep-2取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hep-2細(xì)胞，同前藥物分組處理hep-2細(xì)胞，24h后按PI／AnnexinV-FITC試劑盒操作標(biāo)記細(xì)胞和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，每組重復(fù)3次。細(xì)胞凋亡比率A1按以下公式計(jì)算：A1（%）＝亞二倍峰細(xì)胞數(shù)／細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用±s表示，MTT單藥組內(nèi)采用單因素方差分析加最小顯著差（least significant difference，LSD）法兩兩比較各濃度的抑制率，MTT聯(lián)合實(shí)驗(yàn)采用t檢驗(yàn)。RT-PCR與流式細(xì)胞術(shù)組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況，結(jié)果表明，hep-2細(xì)胞經(jīng)不同濃度伊洛馬司他、卡培他濱單獨(dú)處理24h后，細(xì)胞生長(zhǎng)程度受到不同程度的抑制（表1、2），且抑制程度依賴于藥物劑量的增加，不同濃度抑制率間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（伊洛馬司他組F＝144.167，P＜0.05；卡培他濱組F＝60.131，P＜0.05）。進(jìn)一步LSD法兩兩比較各濃度的抑制率，伊洛馬司他組中任意濃度間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），卡培他濱組中任意兩濃度間差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)SPSS軟件求得伊洛馬司他的10%的細(xì)胞抑制濃度（IC10）和IC50分別為8μg／mL和130μg／mL，卡培他濱的IC10與IC50分別為100μg／mL和910μg／mL。在聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)中采用t檢驗(yàn)比較，伊洛馬司他＋卡培他濱聯(lián)合濃度（8±100）μg／mL的抑制率明顯高于濃度（8±0）μg／mL和濃度（0±100）μg／mL，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝8.421，P＜0.05；t＝7.009，P＜0.05）；聯(lián)合濃度（40±400）μg／mL的抑制率也明顯高于濃度（40±0）μg／mL和（0±400）μg／mL，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝10.226，P＜0.05；t＝8.879，P＜0.05）。伊洛馬司他＋卡培他濱聯(lián)合濃度（8±100）μg／mL組Q值為1.45，為協(xié)同作用；濃度（40±400）μg／mL組 Q值為1.05，為相加作用。

表1 伊洛馬司他對(duì)hep-2細(xì)胞的增殖抑制情況（±s）

表1 伊洛馬司他對(duì)hep-2細(xì)胞的增殖抑制情況（±s）

伊洛馬司他用藥濃度（μg／mL） A值 抑制率（%）2.5 1.154±0.004 2.85±0.34 5.0 1.112±0.005 6.42±0.44 10.0 1.076±0.006 9.34±0.61 20.0 1.012±0.016 14.67±1.53 40.0 0.823±0.039 30.67±3.05

表2 卡培他濱對(duì)hep-2細(xì)胞的增殖抑制抑制情況（±s）

表2 卡培他濱對(duì)hep-2細(xì)胞的增殖抑制抑制情況（±s）

卡培他濱用藥濃度（μg／mL） A值 抑制率（%）50 0.177±0.002 3.24±0.96 100 0.166±0.004 9.31±1.88 200 0.134±0.005 27.08±3.12 400 0.118±0.004 35.54±2.50 800 0.107±0.004 41.56±1.93

2.2 RT-PCR檢測(cè)各組hep-2細(xì)胞MMP-9mRNA表達(dá)的變化 RT-PCR結(jié)果表明，各組均檢測(cè)到MMP-9的表達(dá)。半定量行t檢驗(yàn)顯示，卡培他濱與正常組相比，MMP-9的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝2.570，P＞0.05）；伊洛馬司他組與聯(lián)合用藥組的MMP-9mRNA的表達(dá)水平均低于正常組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；并且聯(lián)合用藥組 MMP-9mRNA的表達(dá)水平低于伊洛馬司他組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組為0.557±0.017，伊洛馬司他組為0.484±0.021，卡培他濱組為0.530±0.006，聯(lián)合用藥組為0.369±0.002。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組hep-2細(xì)胞凋亡率的變化 hep-2細(xì)胞凋亡率對(duì)照組為（9.47±0.81）%，伊洛馬司他組為（14.44±1.09）%，卡培他濱組為（16.33±1.20）%，聯(lián)合用藥組為（23.47±1.16）%。經(jīng)t檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，伊洛馬司他組和卡培他濱組處理hep-2細(xì)胞24h后，凋亡率均高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合用藥組處理hep-2細(xì)胞24h后，凋亡率高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

喉癌是頭頸部常見惡性腫瘤，浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是喉癌的主要的生物學(xué)特性，也是喉癌患者死亡的主要原因。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和基底膜（BM）的降解是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的首要環(huán)節(jié)，MMPs幾乎能降解ECM中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，因此在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用。而現(xiàn)在喉癌中研究最多最廣的是Ⅳ型膠原酶（MMP-9和MMP-2）。MMP-9屬于明膠酶類，它可降解BM的主要成分膠原Ⅳ，其能與整合素結(jié)合從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞黏附性和運(yùn)動(dòng)能力；也能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）加速腫瘤轉(zhuǎn)移［3-4］。最新研究還發(fā)現(xiàn)，MMP-9可切割蛋白酶連接蛋白-1（PN-1）來(lái)調(diào)控腫瘤的轉(zhuǎn)移［5］。MMPIs是當(dāng)前抗腫瘤藥物中很有發(fā)展前景的一類，從來(lái)源可分為天然和人工合成兩大類。組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs）是MMPs的天然抑制劑，其和MMPs的表達(dá)不平衡在喉癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用［6］。合成的MMPIs主要是設(shè)計(jì)來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的MMPs的致瘤潛能，目前主要有馬立馬司他，BAY129566，伊洛馬司他等。

有關(guān)基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑在腫瘤中的研究在國(guó)內(nèi)外已見較多報(bào)道，例如Sun等［7］研究發(fā)現(xiàn)，由病毒介導(dǎo)的RNA干擾MMP-9基因沉默可以抑制喉鱗狀細(xì)胞癌浸潤(rùn)和生長(zhǎng)；李為等［8］認(rèn)為TIMP-1的表達(dá)和腫瘤的發(fā)生具有明顯的負(fù)相關(guān)性；Almholt等［9］也發(fā)現(xiàn)采用伊洛馬司他（GM6001）處理的乳腺癌MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠與安慰劑處理的小鼠相比，乳腺癌的平均轉(zhuǎn)移量減少了至少10倍。

化療藥物卡培他濱是一種氟尿嘧啶氨甲酸酯類藥物，它是氟尿嘧啶（5-FU）的前體，口服后以完整藥物形式經(jīng)腸黏膜進(jìn)入肝臟，并轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性成分5-FU，起到靶向性殺傷腫瘤細(xì)胞作用，具有高效、低毒的特點(diǎn)［10］，其存在的問(wèn)題是單藥卡培他濱在治療癌癥時(shí)的效果并不太滿意。

在本實(shí)驗(yàn)中使用人工合成MMPIs伊洛馬司他、卡培他濱單獨(dú)和聯(lián)合處理喉癌hep-2細(xì)胞。伊洛馬司他又名GM6001，一種羧氨酸修飾的二肽，可抑制 MMP-1，-2，-3，-8，-9的活性［2，11］。它不但能可逆性結(jié)合蛋白酶中含鋅離子的活性區(qū)，直接抑制蛋白酶的活性，還可抑制MMPs前體轉(zhuǎn)化為有活性的MMPs，從而抑制腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示伊洛馬司他和卡培他濱單獨(dú)用藥24h后都可抑制喉癌hep-2細(xì)胞的生長(zhǎng)，且呈現(xiàn)濃度依賴性。當(dāng)伊洛馬司他藥物濃度從2.5μg／mL成倍增加至40μg／mL時(shí)，它對(duì)hep-2細(xì)胞的抑制率逐漸增加，此藥的IC10與IC50分別為8μg／mL和130μg／mL；化療藥物卡培他濱藥物劑量從50μg／mL成倍增加至800μg／mL時(shí)，它對(duì)hep-2細(xì)胞的抑制率也隨之增加，此藥物的IC10與IC50分別為100μg／mL和910μg／mL。在伊洛馬司他聯(lián)合卡培他濱用藥24h后發(fā)現(xiàn)，其對(duì)hep-2細(xì)胞的抑制率在相同劑量下明顯高于兩種藥物單獨(dú)用藥24h，且伊洛馬司他與卡培他濱聯(lián)合用藥（8＋100）μg／mL濃度組中兩藥為協(xié)同作用，（40＋400）μg／mL濃度組中為相加作用，這說(shuō)明伊洛馬司他聯(lián)合卡培他濱對(duì)hep-2細(xì)胞的抑制效應(yīng)強(qiáng)于二者單獨(dú)用藥，且在低濃度時(shí)具有協(xié)同作用。同時(shí)，作者使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)喉癌hep-2細(xì)胞的凋亡，為避免非凋亡性殺傷的細(xì)胞太多造成流式細(xì)胞儀檢測(cè)碎片太多，作者選取兩種藥物的IC10濃度進(jìn)行檢測(cè)，作用24h后顯示伊洛馬司他和卡培他濱單獨(dú)用藥都可誘導(dǎo)hep-2的凋亡過(guò)程，兩種藥物聯(lián)合作用后，hep-2細(xì)胞凋亡的程度明顯增加。這表明，伊洛馬司他不但可以抑制hep-2細(xì)胞的增殖，還可誘導(dǎo)其凋亡，從而抑制喉癌的發(fā)生、發(fā)展；并且伊洛馬司他聯(lián)合卡培他濱用藥對(duì)hep-2細(xì)胞的影響明顯優(yōu)于其單獨(dú)用藥。

此外，本研究中采用RT-PCR檢測(cè)喉癌hep-2細(xì)胞中MMP-9mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)MMP-9mRNA在hep-2細(xì)胞中表達(dá)陽(yáng)性，當(dāng)伊洛馬司他IC10濃度單獨(dú)用藥24h后，hep-2細(xì)胞中MMP-9mRNA的表達(dá)水平下降。蘭菁等［12］在宮頸癌HCE1多細(xì)胞球體浸潤(rùn)人臍靜脈內(nèi)皮單層細(xì)胞模型中得到與本實(shí)驗(yàn)類似的結(jié)果，GM6001干預(yù)后的宮頸鱗癌HCE1多細(xì)胞球體MMP-9的表達(dá)明顯降低。這表明伊洛馬司他對(duì)hep-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用以及聯(lián)合卡培他濱用藥的作用，可能與下調(diào)MMP-9mRNA的表達(dá)，抑制 MMP-9的活性有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)卡培他濱不能降低MMP-9mRNA的表達(dá)水平，但當(dāng)兩種藥物在IC10濃度聯(lián)合作用時(shí)，MMP-9mRNA的表達(dá)水平不僅明顯低于對(duì)照組，且低于伊洛馬司他單獨(dú)用藥組，提示卡培他濱雖然對(duì)MMP-9mRNA的表達(dá)水平?jīng)]有影響，但很有可能可促進(jìn)伊洛馬司他對(duì)MMP-9mRNA活性的抑制作用，這也進(jìn)一步說(shuō)明兩藥物在IC10濃度聯(lián)合作用時(shí)具有協(xié)同作用。

綜上所述，伊洛馬司他與卡培他濱聯(lián)合用藥可明顯增強(qiáng)單藥對(duì)喉癌hep-2細(xì)胞的抑制效應(yīng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，同時(shí)推測(cè)伊洛馬司他的作用機(jī)制可能是下調(diào)MMP-9的表達(dá)水平，從而抑制喉癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。這些都提示MMPI伊洛馬司他有可能作為臨床化療藥物良好的輔助藥物，為喉癌和其他惡性腫瘤的聯(lián)合藥物治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但是，伊洛馬司他和卡培他濱聯(lián)合應(yīng)用的不良反應(yīng)是否減少，最為適合的配比劑量，在臨床上實(shí)現(xiàn)的可能性還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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