蘆丁鼠李糖苷酶水解反應(yīng)液中鼠李糖的分離純化

張 美 超，劉 廷 強，王 東 明，金 鳳 燮，魚 紅 閃

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引 言

鼠李糖作為一種單糖，是甘露糖6位的一個羥基被氫取代最后變成—CH3的衍生物［1］，它在自然界主要以L 型存在。鼠李糖在細(xì)菌和植物中分布最為廣泛，主要以與其他糖類或非糖類結(jié)合成多糖、糖苷或植物膠的形式存在于植物或細(xì)菌中。它可以作為藥物的中間體［2］、合成強心藥物、合成香料Furaneol［3－4］，也可與其他物質(zhì)反應(yīng)形成風(fēng)味物、用作甜味劑［5－6］、還可作為腸道滲透測試劑使用［7］，并具有明顯的抗癌的作用［8］。

生產(chǎn)鼠李糖的傳統(tǒng)方法是將天然植物中含有鼠李糖基的大分子天然苷類化合物，進(jìn)行酸堿水解后，通過分離純化技術(shù)獲得鼠李糖純品。但是由于鼠李糖多與其他單糖共存于天然苷類化合物中，酸堿水解后，產(chǎn)物含有多種單糖，不利于鼠李糖后續(xù)的分離純化，而且該法對環(huán)境污染大，因此不適宜大量制備。生物酶法因其具有水解特異性好、環(huán)境友好等特點，為鼠李糖的制備提供了新的思路。已有文獻(xiàn)報道從自然界篩選菌株與天然植物中的有效成分共發(fā)酵從而轉(zhuǎn)化生成鼠李糖的工藝，李玉山等［9］利用酵母發(fā)酵，從蘆丁水解液中制備L－鼠李糖，其質(zhì)量濃度可達(dá)9.52g／L；魏勝華等［10］也利用酵母發(fā)酵轉(zhuǎn)化柚皮苷得到了高純度的鼠李糖。本實驗室前期已篩選出一種蘆?。粒罄钐擒彰福撁改芴禺愋运馓J丁上的鼠李糖苷鍵，生成異槲皮苷和鼠李糖［11］。本論文通過大孔吸附樹脂，結(jié)合結(jié)晶法，對蘆丁水解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，從而制備高純度的鼠李糖，為生物轉(zhuǎn)化法大量生產(chǎn)鼠李糖提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

鼠李糖、蘆丁、槲皮素、異槲皮苷樣品，美國Sigma公司；菌種Absidiasp.R9g，大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院菌種保藏所；薄層層析板Silica Gel－60－F254，德國Merck 公司；SP207 大孔吸附樹脂，日本三菱化成工業(yè)公司。

1.2 方 法

1.2.1 大孔吸附樹脂分離酶解產(chǎn)物

采用由日本三菱化成工業(yè)公司生產(chǎn)的Sepabeads SP207 大孔吸附樹脂，它以聚苯乙烯基苯為基體，并在苯乙烯基體上接了一個溴，非常適合分離蘆丁、異槲皮苷等極性不大的芳香類化合物。24g蘆丁經(jīng)酶解后，酶解液反復(fù)上樣，薄層層析跟蹤檢測，直至異槲皮苷被充分吸附為止。對吸附達(dá)飽和的SP207大孔吸附樹脂柱，用去離子水充分洗滌，收集鼠李糖粗液，進(jìn)行減壓濃縮，即為鼠李糖粗糖液。

1.2.2 鼠李糖的精制

取濃縮后的鼠李糖粗糖液，分別配制糖溶液質(zhì)量濃度為0.60、0.50、0.40、0.30、0.20、0.10g／mL的鼠李糖溶液各4 mL，并放于干燥器中靜置結(jié)晶。定期觀察晶體的生長狀態(tài)，待晶體析出，分別收集晶體，干燥。

1.2.3 鼠李糖的檢測方法

1.2.3.1 薄層層析法（TLC）檢測

用微量點樣器吸取標(biāo)準(zhǔn)品及樣品，點樣于薄層層析板上，將點好樣品的薄層層析板放入層析缸中展開。糖類物質(zhì)：展開劑為V（正丁醇）∶V（吡啶）∶V（水）＝6∶4∶1，顯色劑為苯酚－硫酸（3g苯酚加5mL濃硫酸，再加95mL無水乙醇）。黃酮類物質(zhì)：展開劑為V（乙酸乙酯）∶V（丁酮）∶V（甲醇）∶V（水）＝10∶7∶1∶1，于紫外燈下觀察。比較樣品點與標(biāo)準(zhǔn)品點位置可知樣品中所含成分。

1.2.3.2 高效液相色譜法（HPLC）檢測

分別取20μL 鼠李糖和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液（1.0mg／mL）和待測樣品溶液（1.0 mg／mL）進(jìn)行HPLC檢測。通過待測樣品HPLC圖譜與鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品及葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜的出峰時間比對來確定樣品的組分。HPLC 條件如下：色譜柱，Kromasil NH2（4.6 mm×250 mm，5μm），流動相為V（乙腈）∶V（水）＝80∶20，體積流量為1 mL／min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為20μL，載氣為氮氣，體積流量為2L／min，載氣壓力為0.1 MPa，ELSD 的漂移管溫度為80 ℃。

1.2.3.3 DNS測糖法

配制1mg／mL的鼠李糖溶液25mL，分別取1、2、3、4、5mL于5支刻度管中，并分別用去離子水定容至10 mL，即為標(biāo)準(zhǔn)品鼠李糖梯度溶液。以標(biāo)準(zhǔn)糖濃度作縱坐標(biāo)，光密度OD540nm為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測定參照標(biāo)準(zhǔn)曲線測定步驟，并做3個平行實驗。通常所測樣品的吸光值為0.2～0.8，有較好的線性趨勢，因此糖液如果濃度過高，需要稀釋后再進(jìn)行測定，以減小誤差。

2 結(jié)果與討論

2.1 SP207大孔吸附樹脂分離RhaR酶反應(yīng)液

24g蘆丁經(jīng)酶水解后，采用SP207大孔吸附樹脂對水解液中的異槲皮苷和鼠李糖進(jìn)行初步分離。如圖1 可知，經(jīng)SP207 大孔吸附樹脂吸附后，水洗脫溶液中主要含有鼠李糖，幾乎不含有異槲皮苷，說明SP207大孔吸附樹脂法分離鼠李糖和異槲皮苷的效果較好，分離得到的鼠李糖粗糖液中不含有異槲皮苷。水洗脫液經(jīng)濃縮后，經(jīng)DNS法測得粗糖液中鼠李糖的質(zhì)量為4.18g，得率為17.4%。

圖1 大孔吸附樹脂分離酶反應(yīng)產(chǎn)物的TLC檢測Fig.1 TLC pattern of separation of enzymatic products by macroporous resin

2.2 鼠李糖的精制

將鼠李糖粗糖液分別配制不同濃度的鼠李糖溶液，于添加變色硅膠的密閉容器中靜置結(jié)晶，觀察晶體的生長狀態(tài)、晶體形態(tài)，如表1所示。由表1可知，當(dāng)糖質(zhì)量濃度較小時，不利于形成晶核，所以無法結(jié)晶。隨著糖質(zhì)量濃度的增加，溶液的過飽和狀態(tài)越來越高，有利于晶體的析出，出晶時間也隨之加快，晶體得率也隨之提高；當(dāng)糖質(zhì)量濃度過高、達(dá)到飽和狀態(tài)時，糖溶液的黏度過大反而會抑制晶體析出，晶體得率反而下降，甚至無法析出晶體。因此糖質(zhì)量濃度應(yīng)在操作條件允許的范圍內(nèi)取最大值。從鼠李糖結(jié)晶溶液中挑取部分晶體放置在Motic AE31熒光倒置顯微鏡下觀察并拍攝晶體形態(tài)，結(jié)果見圖2。

表1 鼠李糖晶體表觀形態(tài)及結(jié)晶得率數(shù)據(jù)Tab.1 Surface morphology and crystallization yield of rhamnose

由圖2及干品數(shù)據(jù)可知，當(dāng)鼠李糖水溶液到達(dá)其過飽和度開始析出晶體時，在一定的時間范圍內(nèi)，糖質(zhì)量濃度為0.1～0.5g／mL 的鼠李糖溶液均能析出晶體，只是形成的晶體多為細(xì)碎較小的顆粒狀；當(dāng)糖質(zhì)量濃度為0.4g／mL 時，晶體顆粒較為適中，透光率也較好；當(dāng)糖質(zhì)量濃度大于0.4g／mL時，晶體顆粒越來越大，透光率相對降低，干燥后的晶體表面能觀察到有色素附著。

鼠李糖液質(zhì)量濃度、結(jié)晶速率和質(zhì)量之間有著密切聯(lián)系，隨著糖質(zhì)量濃度的升高，有利于糖液快速達(dá)到過飽和狀態(tài)，加快結(jié)晶速率，提高了晶體得率。但是當(dāng)糖質(zhì)量濃度過高時，破壞了溶液的動態(tài)平衡，結(jié)晶速率和結(jié)晶率反而降低。同時，糖質(zhì)量濃度過高時，溶液中的雜質(zhì)也容易析出，造成了晶體析出時伴隨著晶體表面上雜質(zhì)的附著，影響了晶體的質(zhì)量。

2.3 高效液相色譜測定純度

配制1.0 mg／mL 的鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液和1.0mg／mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，并以大批量結(jié)晶所得晶體作為待測樣品配制1.0mg／mL 的待測樣品溶液。分別取20 μL 進(jìn)行HPLC 檢測，HPLC檢測圖譜見圖3，所得數(shù)據(jù)如表2 所示。由圖3和表2數(shù)據(jù)可知，結(jié)晶樣品經(jīng)HPLC 檢測均為單一峰，且保留時間均與鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品出峰保留時間相近，而在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的出峰保留時間處無峰出現(xiàn)，說明結(jié)晶樣品中已不含葡萄糖，而為純度較高的鼠李糖晶體，純度為99.0%。

表2 鼠李糖結(jié)晶樣品HPLC圖解析Tab.2 HPLC pattern analysis of rhamnose samples

3 結(jié) 論

在生物酶法轉(zhuǎn)化蘆丁研究基礎(chǔ)之上，采用SP207大孔吸附樹脂法對酶解產(chǎn)物中鼠李糖進(jìn)行分離，其中24g蘆丁的水解產(chǎn)物經(jīng)分離可得到鼠李糖的質(zhì)量為4.18g，得率為17.4%。分離得到的糖液進(jìn)行濃縮后可直接進(jìn)行結(jié)晶精制，當(dāng)濃縮至0.4g／mL 時達(dá)到過飽和狀態(tài)，結(jié)晶所得晶體顆粒飽滿，無色透明，純度可達(dá)99.0%。該研究方法分離效果好，鼠李糖得率較高，且操作簡單，具有一定的工業(yè)化應(yīng)用前景。

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