誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞技術(shù)及應(yīng)用研究進(jìn)展

石 嶸，周玨宇，鄭文嶺，馬文麗

(南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所，廣東廣州 510515)

誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPS cells)研究是近年來生命科學(xué)領(lǐng)域的重大突破。在傳統(tǒng)的多潛能干細(xì)胞研究中，人們從哺乳動(dòng)物的胚泡中直接獲取胚胎干細(xì)胞，或利用體細(xì)胞核移植技術(shù)、成熟細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞融合等方法獲得成熟細(xì)胞的再編程，并利用其多能性的特點(diǎn)，將其定向誘導(dǎo)分化后用于帕金森病、神經(jīng)損傷及糖尿病等疾病的治療。然而，不論是胚泡的來源還是進(jìn)一步的應(yīng)用，都不可避免受到倫理學(xué)方面的問題及移植排斥反應(yīng)等限制。而唯一的解決辦法就是從患者體內(nèi)獲取細(xì)胞并將其直接誘導(dǎo)成多能干細(xì)胞，這種細(xì)胞就是現(xiàn)今所說的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)。2006年8月日本京都大學(xué)Shinya Yamanaka課題組首先在《Cell》期刊上發(fā)表文章，證實(shí)了iPS細(xì)胞產(chǎn)生的可能性［1］。由于其具有非常誘人的應(yīng)用前景，在最近幾年中迅速成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題，并于2008年被《Science》評(píng)為年度十大科技進(jìn)展最高獎(jiǎng)，Yamanaka更因此獲得了2012年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。本文從iPS細(xì)胞的可行性研究、iPS細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)優(yōu)化研究、iPS細(xì)胞誘導(dǎo)機(jī)制研究、iPS細(xì)胞的臨床應(yīng)用、當(dāng)前研究存在的問題這5個(gè)方面進(jìn)行了概述。

1 iPS細(xì)胞的可行性研究

2006年，Shinya Yamanaka研究組首先通過對(duì)24個(gè)可能的候選基因篩選后發(fā)現(xiàn)，采用反轉(zhuǎn)錄病毒載體，僅需要向小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast cell，MEF cell)及成體成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入 Oct3/4、Sox2、c-Myc和 Klf4這4個(gè)基因，就可以誘發(fā)細(xì)胞的再編程，從而產(chǎn)生形態(tài)學(xué)上類似于胚胎干細(xì)胞，即可以表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物的iPS細(xì)胞。這種iPS細(xì)胞植入裸鼠皮下，可以形成向3個(gè)胚層分化的畸胎瘤，而植入胚泡后則可形成小鼠胚胎，從而充分地證明了誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞具有多能性的特點(diǎn)，將其命名為iPS細(xì)胞［1－2］。然而，不同種屬、不同組織來源、不同年齡、不同疾病患者的細(xì)胞能否誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS細(xì)胞是決定iPS未來是否具有臨床應(yīng)用價(jià)值的重點(diǎn)。該實(shí)驗(yàn)迅速得到了其他實(shí)驗(yàn)室的重復(fù)證實(shí)［3－4］，并在人類胎兒、新生兒及成體來源的細(xì)胞中取得了成功［5－7］。與此同時(shí)，多個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別證實(shí)成年小鼠皮膚細(xì)胞［8］、成熟 B淋巴細(xì)胞［9］、肝細(xì)胞、胃細(xì)胞［10］、神經(jīng)干細(xì)胞［11－12］等多個(gè)不同組織來源、不同分化程度的細(xì)胞均可被誘導(dǎo)成為iPS細(xì)胞。哈佛醫(yī)學(xué)院George Q．Daley實(shí)驗(yàn)室更是一次性地從人類腺苷酸脫氨酶相關(guān)重癥聯(lián)合免疫缺陷(ADA-SCID)、Shwachman-Bodian-Diamond綜合征(SBDS)、III型高雪氏病 (GD)、杜氏(DMD)及貝克肌營養(yǎng)不良(BMD)、帕金森病(PD)、亨廷頓癥(HD)、青少年 1型糖尿病(JDM)、唐氏綜合征(DS)/21三體綜合征、以及Lesch-Nyhan綜合征攜帶者體細(xì)胞中成功誘導(dǎo)了iPS細(xì)胞［13］。此外，老年人體細(xì)胞也被證實(shí)可以被誘導(dǎo)成為iPS細(xì)胞。Dimos等［14］報(bào)道將一位患有肌萎縮側(cè)索硬化的82歲老年女性的成纖維細(xì)胞成功誘導(dǎo)成為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。Stadtfeld 等［15］和 Daley 等［16］分別發(fā)表文章提出了iPS細(xì)胞誘導(dǎo)成功的分子標(biāo)志物改變、功能性改變及其多潛能性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

2 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)優(yōu)化研究

在證實(shí)iPS細(xì)胞可行性的同時(shí)，技術(shù)改進(jìn)更是層出不窮。

首先是誘導(dǎo)因子的改進(jìn)，在誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的4個(gè)基因中，c-Myc是明確的癌基因，Klf4也被證實(shí)與腫瘤發(fā)生相關(guān)，Yamanaka課題組通過改變篩選方法獲得了與 ES細(xì)胞更為接近的iPS細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)20%的c-Myc轉(zhuǎn)染細(xì)胞后代出現(xiàn)腫瘤，以及用反轉(zhuǎn)錄病毒做載體并不安全［17］。同時(shí) Meissner 等［4］采用了新的篩選方法，并認(rèn)為通過形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)判斷而不必用抗性篩選就可以直接從野生型細(xì)胞獲得iPS細(xì)胞。因此，Yamanaka等［18］通過去除c-Myc轉(zhuǎn)染及藥物篩選，證實(shí)其他3個(gè)基因便可以使野生型小鼠及人細(xì)胞誘導(dǎo)成為iPS細(xì)胞，從而避開了c-Myc高表達(dá)導(dǎo)致腫瘤的可能。隨后，Huangfu等［19］發(fā)現(xiàn)Oct4和Sox2兩個(gè)基因就可以誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞產(chǎn)生iPS細(xì)胞，更進(jìn)一步避開了Klf4導(dǎo)致腫瘤的可能性。Feng等［20］在小鼠體內(nèi)通過孤獨(dú)受體Esrrb與Oct4、Sox2基因配合，也可誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS細(xì)胞。Kim等［11－12］證實(shí)，單一向成年小鼠神經(jīng)干細(xì)胞中導(dǎo)入Oct4與Sox2兩個(gè)基因，甚至Oct4一個(gè)基因即可將其轉(zhuǎn)化成iPS細(xì)胞，并可在體外將其誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)干細(xì)胞、心肌細(xì)胞、生殖細(xì)胞。目前比較一致的觀點(diǎn)就是c-Myc啟動(dòng)了再編程的過程，但在細(xì)胞向干細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過程中，則是Oct3/4、Sox2和Klf4這3個(gè)基因的作用，因此，c-Myc在iPS的過程中并非必需的因子。

除了導(dǎo)入基因進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外，研究者們也嘗試了其他各種類型生物分子的誘導(dǎo)方法，Miyoshi等［21］和 Anokye-Danso 等［22］先后證實(shí)可以通過導(dǎo)入microRNA誘導(dǎo)形成 iPS細(xì)胞。Kim等［23］和 Zhou等［24］證實(shí)可以通過直接導(dǎo)入再編程蛋白誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的生成。此外Warren等［25］通過體外人工合成并修飾的mRNA也高效誘導(dǎo)產(chǎn)生了iPS細(xì)胞，而Woltjen等［26］則通過轉(zhuǎn)座重編程將成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成了iPS細(xì)胞。

其次是誘導(dǎo)方法的改進(jìn)和安全性的提高。由于最初采用的反轉(zhuǎn)錄病毒有隨機(jī)摻入宿主基因組的特點(diǎn)，因此從應(yīng)用安全性角度考慮，研究者們改變了多種基因轉(zhuǎn)染的方法，并分別取得了成功。Stadtfeld等［27］證實(shí)可以通過腺病毒載體轉(zhuǎn)入基因，從而避免病毒基因摻入。Okita等［28］分別將c-Myc單獨(dú)克隆在一個(gè)載體上，Oct3/4、Sox2和Klf4克隆在另一個(gè)載體上，這兩個(gè)載體均為非病毒載體，并以此轉(zhuǎn)染細(xì)胞，結(jié)果表明這些基因不整合入基因組，且成功誘導(dǎo)了iPS細(xì)胞。Jaenisch實(shí)驗(yàn)室則通過采用強(qiáng)力霉素(doxycycline)誘導(dǎo)表達(dá)載體前病毒，構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因小鼠及細(xì)胞模型，使得iPS細(xì)胞的研究簡化成通過單一藥物誘導(dǎo)即可獲得iPS細(xì)胞，從而使誘導(dǎo)過程實(shí)驗(yàn)背景大為簡化，為機(jī)制研究以及誘導(dǎo)基因類似物的小分子化合物的篩選建立了模型［29－30］。

再次就是誘導(dǎo)效率的提高和速度的加快。通常iPS細(xì)胞的產(chǎn)生需要30 d左右，而其誘導(dǎo)效率較低。Huangfu等［31］通過導(dǎo)入小分子復(fù)合物DNA轉(zhuǎn)甲基酶和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑，可以將iPS細(xì)胞誘導(dǎo)效率提高100倍。Aasen等［32］通過改進(jìn)反轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)，誘導(dǎo)人包皮角質(zhì)細(xì)胞，將誘導(dǎo)效率提高100倍以上，誘導(dǎo)速度增加1倍。

3 iPS細(xì)胞分子機(jī)制研究

在iPS細(xì)胞的產(chǎn)生機(jī)制方面，Yamanaka研究組通過基因芯片等大規(guī)模篩選方法找到了多個(gè)與iPS細(xì)胞產(chǎn)生相關(guān)的基因［1－2］，并發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)過程伴隨著ES細(xì)胞標(biāo)記基因的激活與表達(dá)。Sridharan等［33］通過ChIP和基因芯片在全基因組水平上檢測4個(gè)基因?qū)τ趩?dòng)子的結(jié)合和基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)iPS細(xì)胞與ES細(xì)胞中這4個(gè)基因的結(jié)合位點(diǎn)非常相似，而在部分再編程細(xì)胞(未完全多能化)c-Myc結(jié)合的基因被激活，但其他3個(gè)基因的下游基因沒有被結(jié)合及激活。隨后證明c-Myc在起始再編程的過程中發(fā)揮重要作用，而其他3個(gè)基因則有助于細(xì)胞多能性的恢復(fù)。

在iPS細(xì)胞產(chǎn)生過程中，盡管從一開始Yamanaka課題組便發(fā)現(xiàn)端粒、端粒酶及端粒相關(guān)蛋白也發(fā)揮了一定的作用，并影響其產(chǎn)生機(jī)制［1－2］，但研究迄今尚遠(yuǎn)不夠全面。端粒研究領(lǐng)域著名的Maria課題組對(duì)iPS細(xì)胞形成過程中的端粒以及端粒酶變化做了較為深入的論述［34］。該文指出在將成熟細(xì)胞誘導(dǎo)成為iPS細(xì)胞的過程中，發(fā)現(xiàn):1)細(xì)胞端粒依賴端粒酶變長;2)出現(xiàn)ES細(xì)胞特有的端粒染色質(zhì)特征(如特定位點(diǎn)的甲基化);3)此端粒酶的激活不依賴c-Myc調(diào)控;4)在端粒非常短的 Terc－/－的小鼠中，iPS細(xì)胞的成率低，傳代后很快失去多能性;5)端粒在iPS細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄增加;6)老年捐獻(xiàn)者細(xì)胞誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞后端粒長度增加。但究竟端粒酶如何被激活，是否存在翻譯后加工機(jī)制的作用，以及端粒結(jié)合蛋白shelterin在對(duì)端粒酶及端粒長度的調(diào)控中發(fā)揮何種作用，仍有待進(jìn)一步深入研究闡明。

此外，有關(guān)iPS細(xì)胞與ES細(xì)胞的比較研究對(duì)于闡述iPS細(xì)胞的分子機(jī)制具有重要意義。多個(gè)研究組的研究結(jié)果表明，盡管兩種細(xì)胞均具有多能性，但仍然存在本質(zhì)的差別，一些鼠源性的iPS細(xì)胞畸胎瘤形成能力低于ES細(xì)胞，而人源性iPS細(xì)胞分化成為造血系統(tǒng)、神經(jīng)上皮、神經(jīng)元細(xì)胞系的能力弱于ES細(xì)胞［35－37］。對(duì)此學(xué)術(shù)界持有不同看法，有觀點(diǎn)認(rèn)為iPS細(xì)胞的分化能力本身就低于ES細(xì)胞，而更多的研究組則認(rèn)為來源細(xì)胞(誘導(dǎo)前細(xì)胞)會(huì)在iPS細(xì)胞內(nèi)留下表觀遺傳學(xué)的記憶，并對(duì)iPS的分化潛能產(chǎn)生特定的影響［38－39］。Bock 等［40］進(jìn)一步在全基因水平構(gòu)建了ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞的甲基化譜及基因表達(dá)譜，在比較ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞差異的同時(shí)，建立了一套評(píng)價(jià)多能干細(xì)胞特點(diǎn)及其分化潛能的評(píng)估體系，對(duì)于深入研究iPS細(xì)胞的分子機(jī)制提供了新的依據(jù)。

4 iPS細(xì)胞的臨床應(yīng)用研究

iPS細(xì)胞為研究臨床疾病的發(fā)病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新藥物和新治療方法以及開展個(gè)性化治療方面提供了重要的技術(shù)支撐。制備疾病特異性干細(xì)胞長期以來都是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的目標(biāo)，而iPS細(xì)胞的出現(xiàn)使得該目標(biāo)變成了一項(xiàng)常規(guī)操作，當(dāng)前有大量報(bào)道將各種患者來源的細(xì)胞誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括帕金森病(PD)、亨廷頓癥(HD)、肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)、脊髓性肌萎縮(SMA)、唐氏綜合征、脆性X綜合征等，血液系統(tǒng)疾病包括范可尼貧血、腺苷脫氨酶嚴(yán)重復(fù)合型免疫缺乏癥(ADASCAD)、鐮刀細(xì)胞型貧血、β-地中海貧血、原發(fā)性骨髓纖維化等，代謝系統(tǒng)疾病包括1型糖尿病、III型高雪氏病(GD)等。這些細(xì)胞模型為深入研究疾病的發(fā)病機(jī)制、體外藥物篩選、治療效果評(píng)價(jià)方面提供了一個(gè)非常有用的技術(shù)平臺(tái)。

此外，在細(xì)胞替代治療方面，iPS細(xì)胞由于不存在異體移植免疫排斥以及后續(xù)必須應(yīng)用抗排斥反應(yīng)藥物的問題，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。通過誘導(dǎo)iPS細(xì)胞定向分化，然后將細(xì)胞移植到特定部位發(fā)揮作用，用于治療疾病，其中最具有代表性的一個(gè)例子就是Isacson等［41］通過將iPS細(xì)胞誘導(dǎo)成為多巴胺能神經(jīng)元，然后移植到帕金森病模型大鼠的腦內(nèi)，發(fā)現(xiàn)能夠明顯改善其癥狀，從而為iPS細(xì)胞在腦組織內(nèi)的細(xì)胞替代治療提供了重要的理論依據(jù)。此外，Hanna等［8］還將其應(yīng)用于小鼠鐮形細(xì)胞性貧血疾病模型的治療，Xu等［42］將其應(yīng)用于鼠血友病A模型的治療，并取得了良好的療效。而已建立的藥物誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的小鼠及細(xì)胞模型［29－30］，使得進(jìn)一步的篩選研究及臨床應(yīng)用成為可能，這一切都使得iPS細(xì)胞的研究具有非常誘人的應(yīng)用前景。

iPS細(xì)胞同時(shí)也為基因治療提供了新的希望，在基因修復(fù)－細(xì)胞替代治療方面，利用上述疾病來源的iPS細(xì)胞模型，可以完全不考慮免疫排斥因素，從而將重點(diǎn)全部放在基因修復(fù)的工作中。

《Science》近期還相繼報(bào)道日本京都大學(xué)的Mitinori Saitou研究組將小鼠ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞在體外誘導(dǎo)成為卵子和精子細(xì)胞［43－45］，這種體外將干細(xì)胞定向誘導(dǎo)成為單倍體生殖細(xì)胞的方法，為臨床不孕癥的解決提供了新的理論依據(jù)及新方案。

5 當(dāng)前研究存在的問題

然而，要真正能夠應(yīng)用到臨床，iPS細(xì)胞研究領(lǐng)域的3大問題仍急需進(jìn)一步闡明和優(yōu)化，即iPS細(xì)胞誘導(dǎo)效率問題、iPS細(xì)胞產(chǎn)生的機(jī)制問題、以及iPS細(xì)胞的安全性問題。其中更是以闡明iPS細(xì)胞產(chǎn)生的機(jī)制最為重要。

5.1 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)效率問題

當(dāng)前的iPS細(xì)胞研究尚屬于實(shí)驗(yàn)性探索的階段，根據(jù)絕大多數(shù)研究者的文獻(xiàn)報(bào)道，從開始誘導(dǎo)到建立穩(wěn)定的iPS細(xì)胞克隆所需要的時(shí)間至少在3個(gè)星期以上，而誘導(dǎo)效率則低于1/5 000 ～1/10 000［1-2，7］，也就是說1萬個(gè)細(xì)胞中能被成功再編程并誘導(dǎo)成為干細(xì)胞的不超過1～2個(gè)。如果單純從研究的角度來說，這種效率其實(shí)已經(jīng)足夠高了，因?yàn)閱渭円淮螌?shí)驗(yàn)就可以獲得數(shù)個(gè)iPS細(xì)胞克隆。然而，如果從臨床應(yīng)用的角度考慮，涉及到從患者體內(nèi)分離并培養(yǎng)大量細(xì)胞以及臨床治療的時(shí)效性問題，則確實(shí)需要大大提高誘導(dǎo)效率，縮短誘導(dǎo)所需時(shí)間。目前主要通過選取更容易被誘導(dǎo)再編程的細(xì)胞來源、改進(jìn)誘導(dǎo)方法等手段來提高誘導(dǎo)效率，而此方面的研究必將是今后iPS細(xì)胞走向臨床應(yīng)用領(lǐng)域的重點(diǎn)方向之一。

5.2 iPS細(xì)胞產(chǎn)生的機(jī)制問題

目前研究者們對(duì)iPS細(xì)胞的產(chǎn)生機(jī)制仍不明確，除了認(rèn)為是由導(dǎo)入的4個(gè)基因激活了干細(xì)胞相關(guān)因子、誘導(dǎo)了細(xì)胞的再編程外，最初的研究也并不確定是否是因?yàn)榉崔D(zhuǎn)錄病毒摻入了細(xì)胞的基因組的特定位點(diǎn)導(dǎo)致再編程，或是在外周成纖維細(xì)胞培養(yǎng)中本身就存在具有未分化特性的祖細(xì)胞，還是細(xì)胞基因組已經(jīng)發(fā)生了不能被染色體核型分析所檢測到的微小改變，或者是外成性的改變導(dǎo)致了再編程的發(fā)生［2］。盡管隨著目前研究的進(jìn)展，一些諸如反轉(zhuǎn)錄病毒摻入等可能的因素已經(jīng)被排除，但對(duì)其再編程發(fā)生機(jī)制全貌的了解，目前仍需大量的工作證明。而這一問題若無法解決，研究者們則無法對(duì)于每個(gè)iPS細(xì)胞均是否已徹底完成了再編程進(jìn)行判斷，也無法獲得更為高效、安全的手段來誘導(dǎo) iPS細(xì)胞［46－47］。因此，iPS細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)制的研究已成為限制iPS細(xì)胞發(fā)展以及應(yīng)用的最重要的瓶頸，也必將是未來iPS細(xì)胞研究領(lǐng)域重點(diǎn)突破的科學(xué)難題。

5.3 iPS細(xì)胞的安全性問題

安全性問題是iPS細(xì)胞走向應(yīng)用領(lǐng)域的另一個(gè)重大問題，早期的iPS細(xì)胞誘導(dǎo)主要采用諸如反轉(zhuǎn)錄病毒(retroviruses)或慢病毒(lentiviruses)等病毒載體，但反轉(zhuǎn)錄病毒載體存在整合入宿主細(xì)胞基因組并導(dǎo)致腫瘤的問題，因此在應(yīng)用的安全性上難以滿足需要。目前技術(shù)上的很多改進(jìn)包括采用非病毒載體，甚至采用藥物直接誘導(dǎo)等方式，但即使不存在病毒基因的摻入，非病毒載體的質(zhì)粒片段可能存在整合，藥物也可能誘發(fā)基因的突變［46］。此外，導(dǎo)入的4個(gè)基因中c-Myc具有明確的致腫瘤作用，導(dǎo)入c-Myc的iPS細(xì)胞生成的嵌合體小鼠中50%都會(huì)發(fā)生腫瘤［17］，僅僅導(dǎo)入其他3個(gè)基因同樣也存在一定腫瘤發(fā)生率。如何改進(jìn)并研究出新的低致瘤性的誘導(dǎo)方法、提高iPS細(xì)胞的安全性是未來研究中的重點(diǎn)及難點(diǎn)之一。

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