蠶蛹源ACE抑制肽的穩(wěn)定性和抑制ACE動(dòng)力學(xué)

賈俊強(qiáng) ， 吳瓊英 ， 徐金玲 ， 杜金娟 ， 顏 輝 ， 桂仲爭(zhēng)

（1.江蘇科技大學(xué) 蠶業(yè)研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212018；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212018；3.江蘇科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212018）

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 （Angiotensin-Ⅰ converting enzyme，ACE）是一種調(diào)節(jié)人體血壓的二肽羧基肽酶，廣泛分布在人體組織和血漿中，且在肺毛細(xì)血管中的含量最為豐富[1]。ACE通過控制腎素-血管緊張素系統(tǒng)（Renin-angiotensin system，RAS）和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（Kallikrein-kinin system，KKS）調(diào)節(jié)人體血壓。ACE抑制肽作為生物活性肽的一種，具有無毒副作用和對(duì)正常血壓無影響的優(yōu)點(diǎn)，長(zhǎng)期服用可以達(dá)到預(yù)防、控制和輔助治療高血壓之目的[4]?，F(xiàn)已成功從草魚蛋白[2]、紫菜蛋白[3]、蛋清蛋白[4]、乳清蛋白[5]和麥胚蛋白[6]等食源蛋白中分離得到高活性的ACE抑制肽。

隨著ACE抑制肽研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)貯存環(huán)境、加工工藝和胃腸道酶消化等因素能夠?qū)е翧CE抑制肽的活性降低，甚至喪失[3，7]。 因而，開發(fā)ACE抑制肽時(shí)，除了具有較高的ACE抑制活性外，還要在生產(chǎn)、貯藏及體內(nèi)消化吸收過程中具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。目前，已有大量食源蛋白ACE抑制肽的穩(wěn)定性被研究，如:紫菜源ACE抑制肽[3]和蛋清源ACE抑制肽[7]等。然而，有關(guān)蠶蛹源ACE抑制肽穩(wěn)定性的研究尚未見報(bào)道。

本課題組在前期研究工作中利用酶解技術(shù)從蠶蛹蛋白中制備出了高活性ACE抑制肽[8]。在此基礎(chǔ)上，作者對(duì)蠶蛹源ACE抑制肽的熱穩(wěn)定性、耐酸堿性和抗腸道酶消化能力等性能進(jìn)行研究，同時(shí)，研究了蠶蛹源ACE抑制肽的抑制動(dòng)力學(xué)和抑制后ACE的紫外光譜變化，為蠶蛹源ACE抑制肽的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供技術(shù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和原料 蠶蛹:由農(nóng)業(yè)部蠶桑產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（鎮(zhèn)江）提供。蠶蛹先用乙醚脫脂，50℃烘干后粉碎，過80目篩備用；胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶:均購自生工生物工程（上海）有限公司；堿性蛋白酶（alcalase）:購自諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL）和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）:購自 Sigma-Aldrich公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器 Pellicon小型超濾系統(tǒng):美國Millipore公司；UV-2100型分光光度計(jì):尤尼柯（上海）儀器有限公司；UV-2450紫外吸收分光光度計(jì):日本Shimadzu公司；SSY-H型恒溫水浴鍋:上海三申醫(yī)療器械有限公司；LR10-24A型離心機(jī):北京雷勃爾有限公司；WH-2微型漩渦混合儀:上海滬西分析儀器廠；FDU-2100型冷凍干燥機(jī):上海愛朗儀器有限公司；DC-1500噴霧干燥機(jī):上海達(dá)程實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蠶蛹源ACE抑制肽的制備

1）蠶蛹蛋白的提取:取10 g蠶蛹粉，加入100 mL蒸餾水，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0，在室溫下攪拌1 h后，5 000 r/min離心10 min，取上清液，然后用1 mol/L HCl將其pH調(diào)節(jié)至4.0，靜置30 min后5 000 r/min離心10 min，收集沉淀，將沉淀透析48 h，然后冷凍干燥備用。

2）蠶蛹蛋白的酶解與超濾分離:將蠶蛹蛋白用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為10 g/L懸浮液，在酶解溫度50.8℃、酶解pH 9.0和加酶量3 500 U/g條件下，用Alcalase酶解120 min，酶解結(jié)束后在沸水浴中滅酶5 min，冷卻至室溫后，5 000 r/min離心10 min，收集上清液，將該上清液用截留相對(duì)分子質(zhì)量為5 000的超濾膜進(jìn)行分離，透過液即為蠶蛹源ACE抑制肽。

1.2.2 體外ACE抑制活性的測(cè)定 蠶蛹源ACE抑制肽的體外活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[9]報(bào)道的方法。將10 μL蠶蛹源ACE抑制肽與 10 μL ACE溶液（酶活力為0.1 U/mL，用pH 8.3的100 mmol/L硼酸鈉緩沖溶液（含300 mmol/L NaCl）配制），在37℃下預(yù)熱5 min， 加入 45 μL、5 mmol/L HHL 溶液 （用 pH 8.3的100 mmol/L硼酸鈉緩沖溶液 （含300 mmol/L NaCl）配制），在37℃反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后立即加入 85 μL、1 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)；在反應(yīng)液中加入1 mL乙酸乙酯，振蕩2 min后，4 000 r/min離心10 min，取出800 μL有機(jī)相溶液轉(zhuǎn)入玻璃管中，在100℃下蒸發(fā)30 min，蒸發(fā)后的殘?jiān)屑尤?00 μL雙蒸水，混勻后在228 nm下測(cè)定吸光度（D228nm），每個(gè)樣品重復(fù)3次。另以雙蒸水代替酶解產(chǎn)物作為空白樣品。按下式計(jì)算蠶蛹源ACE抑制肽的體外活性:

式中，I為ACE抑制率；A為空白組的吸光度；B為反應(yīng)體系中沒有加入ACE時(shí)的吸光度；C為反應(yīng)體系中有ACE和蠶蛹源ACE抑制肽時(shí)的吸光度。

1.2.3 蠶蛹源ACE抑制肽的穩(wěn)定性試驗(yàn)

1）熱穩(wěn)定試驗(yàn):將蠶蛹源ACE抑制肽溶液（質(zhì)量濃度0.72 mg/mL）的pH調(diào)節(jié)至7.0，分別在4、37、50、80℃處理不同時(shí)間，測(cè)定其ACE抑制活性。

2）酸、堿穩(wěn)定性試驗(yàn):將蠶蛹源ACE抑制肽溶液（質(zhì)量濃度0.72 mg/mL）的pH值分別調(diào)節(jié)至2.0、5.0、7.0和10.0，在20℃放置不同時(shí)間，測(cè)定其ACE抑制活性。

3）干燥方式試驗(yàn):將干燥的蠶蛹源ACE抑制肽在室溫放置不同時(shí)間，然后將其配置成0.5 mg/mL溶液，測(cè)定ACE抑制活性。冷凍干燥:溫度-85℃，真空度＜10 Pa；噴霧干燥:出風(fēng)口溫度100℃，進(jìn)風(fēng)口溫度190℃，進(jìn)料速度10 mL/min；熱風(fēng)干燥:溫度55℃；真空干燥:溫度45℃，真空度＜0.01 MPa。

4）體外消化試驗(yàn):根據(jù)Wu等[10]報(bào)道的方法（略有修改）進(jìn)行體外消化試驗(yàn)。取100 mL蠶蛹源ACE抑制肽溶液（質(zhì)量濃度0.5 mg/mL），將其pH值調(diào)節(jié)至2.0后，加入胃蛋白酶（1 750 U/g），在37℃下保溫2 h，然后將酶解溶液的pH調(diào)節(jié)至7.0，加入胰蛋白酶（2 500 U/g）和 α-胰凝乳蛋白酶（1 000 U/g），在37℃下保溫4 h后，沸水滅酶10 min，取樣測(cè)定ACE抑制率。

1.2.4 葡聚糖凝膠G-50色譜分析 用蒸餾水作為洗脫液，流速為 1 mL/min，上樣量為 200 μL，凝膠柱規(guī)格為1.0 cm×30 cm，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。

1.2.5 蠶蛹源ACE抑制肽的抑制動(dòng)力學(xué)試驗(yàn) 根據(jù)Barbana等[11]報(bào)道的方法研究蠶蛹源ACE抑制肽的抑制動(dòng)力學(xué)。在不同馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL）底物濃度下，測(cè)量ACE的活性，ACE的活性用 228 nm的吸光度（A228nm）表示，用 1/A228nm和 1/HHL作圖評(píng)價(jià)蠶蛹源ACE抑制肽的抑制模式，并通過曲線的回歸方程得到蠶蛹源ACE抑制肽的抑制常數(shù)Ki。

1.2.6 蠶蛹源ACE抑制肽與ACE作用的紫外光譜分析 在400 μL ACE溶液中迅速加入50 μL蠶蛹源ACE抑制肽，在37℃下分別測(cè)定0、10 min時(shí)的紫外光譜。掃描條件:樣品池的光徑為1 cm，在200～500 nm下用紫外分光光度計(jì)掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 蠶蛹源ACE抑制肽的穩(wěn)定性分析

2.1.1 溫度對(duì)蠶蛹源ACE抑制肽活性的影響 不同溫度對(duì)蠶蛹源ACE抑制肽活性的影響見圖1。從圖1可以看出，在4℃和37℃保存時(shí)，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，蠶蛹源ACE抑制肽的活性基本不變，在3 h時(shí)活性仍然保留初始時(shí)的92.2%以上；當(dāng)保存溫度為50℃時(shí)，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，蠶蛹源ACE抑制肽的活性緩慢降低，在3 h時(shí)活性為初始時(shí)的75.9%；當(dāng)保存溫度為80℃時(shí)，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，蠶蛹源ACE抑制肽的活性迅速降低，在3 h時(shí)活性為初始時(shí)的41.4%，這主要是因?yàn)楦邷丶铀倭薃CE抑制肽的裂解[12]。由此可以看出，蠶蛹源ACE抑制肽在低溫下活性較穩(wěn)定，而在高溫下則活性喪失嚴(yán)重，這與已報(bào)道的紫菜源ACE抑制肽的熱穩(wěn)定性[3]基本一致。

圖1 溫度對(duì)蠶蛹源ACE抑制肽活性的影響Fig.1 Effects of temperature on activities of ACE-inhibitory peptides from silkworm pupae

2.1.2 pH對(duì)蠶蛹源ACE抑制肽活性的影響 不同pH對(duì)蠶蛹源ACE抑制肽活性的影響見圖2。從圖2可以看出，在pH 7條件下保存時(shí)，蠶蛹源ACE抑制肽的活性較穩(wěn)定，保存3 h的活性為初始時(shí)的89.5%；當(dāng)保存pH值為2、5、10時(shí)，蠶蛹源 ACE抑制肽的活性喪失較大，保存3 h后活性分別喪失了56.0%、46.4%和27.5%。試驗(yàn)結(jié)果表明，蠶蛹源ACE抑制肽在中性條件下穩(wěn)定性較好，而在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿條件下穩(wěn)定性較差。這可能是因?yàn)閺?qiáng)酸堿條件造成ACE抑制肽的肽鏈斷裂，結(jié)構(gòu)破壞，最終導(dǎo)致ACE抑制肽的活性降低[3]。

圖2 pH對(duì)蠶蛹源ACE抑制肽活性的影響Fig.2 Effects of pH on activities of ACE-inhibitory peptides from silkworm pupae

2.1.3 干燥方式對(duì)蠶蛹源ACE抑制肽活性的影響干燥方式對(duì)蠶蛹源ACE抑制肽活性的影響見圖3。

圖3 干燥方式對(duì)蠶蛹源ACE抑制肽活性的影響Fig.3 Effects of drying methods on activities of ACE-inhibitory peptides from silkworm pupae

從圖3可以看出，在4種干燥方式中，冷凍干燥對(duì)蠶蛹源ACE抑制肽的活性影響最小，干燥后蠶蛹源ACE抑制肽（0.5 mg/mL）的活性為71.3%；其次為噴霧干燥，干燥后蠶蛹源ACE抑制肽（0.5 mg/mL）的活性為64.6%，為冷凍干燥活性的90.5%；而熱風(fēng)干燥和真空干燥對(duì)蠶蛹源ACE抑制肽的活性影響較大，干燥后蠶蛹源ACE抑制肽的活性迅速下降，僅為冷凍干燥活性的42.3%和56.4%。此外，室溫保存試驗(yàn)表明，冷凍干燥、噴霧干燥、真空干燥和熱風(fēng)干燥的ACE抑制肽均具有良好的穩(wěn)定性，保存60 d后活性基本不變。由此可以看出，冷凍干燥和噴霧干燥是干燥ACE抑制肽的理想方法。然而，由于冷凍干燥存在干燥時(shí)間長(zhǎng)、設(shè)備昂貴、能耗高等缺點(diǎn)，不宜用于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，噴霧干燥是工業(yè)化干燥蠶蛹源ACE抑制肽的最佳選擇。

2.1.4 腸道酶消化對(duì)蠶蛹源ACE抑制肽活性的影響 蠶蛹源ACE抑制肽經(jīng)腸道消化后，其ACE抑制活性變化見表1。從表1可以看出，蠶蛹源ACE抑制肽經(jīng)胃蛋白酶消化后，其活性顯著降低 （P＜0.05），比消化前降低了13.1%，相似的現(xiàn)象也被發(fā)現(xiàn)在蛋清源ACE抑制肽的消化研究中。Miguel研究發(fā)現(xiàn):胃蛋白酶能夠引起蛋清源ACE抑制肽活性降低，使其IC50值比消化前提高了54.5%[13]。這可能是由于胃蛋白酶水解了部分ACE抑制肽，使其成為了失活片段，因而活性降低。然而，經(jīng)胃蛋白酶消化的蠶蛹源ACE抑制肽進(jìn)一步被胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶共同消化后，其活性反而顯著提高（P＜0.05），比胃蛋白酶消化后的活性提高了8.2%。這可能是因?yàn)橐鹊鞍酌负挺?胰凝乳蛋白酶水解后又產(chǎn)生了新的ACE抑制肽，該現(xiàn)象在麥胚源ACE抑制肽的體外消化試驗(yàn)中也被發(fā)現(xiàn)[14]。

表1 腸道酶消化對(duì)蠶蛹源ACE抑制肽活性的影響Table 1 Effects of intestinal enzyme degradation on activities of ACE-inhibitory peptides from silkworm pupae

為了進(jìn)一步研究腸道酶消化對(duì)蠶蛹源ACE 抑制肽活性的影響，分別對(duì)消化前、胃蛋白酶消化和胃蛋白酶+胰蛋白酶+α-胰凝乳蛋白酶消化的蠶蛹源ACE抑制肽進(jìn)行葡聚糖凝膠層析分離，層析分離效果見圖4。從圖4可以看出，消化前和消化后均存在兩個(gè)主要峰a和b。胃蛋白酶消化后，峰a的面積比消化前降低，而峰b的面積比消化前增加，這說明胃蛋白酶消化后，蠶蛹源ACE抑制肽向小相對(duì)分子質(zhì)量轉(zhuǎn)變；當(dāng)進(jìn)一步用胰蛋白酶+α-胰凝乳蛋白酶消化后，其峰a和b分別向右輕微移動(dòng)，這說明胰蛋白酶+α-胰凝乳蛋白酶的消化使蠶蛹源ACE抑制肽的相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)一步變小。此結(jié)果說明，腸道酶消化降解了部分蠶蛹源ACE抑制肽，使其變成失活片段或新的ACE抑制肽，最終導(dǎo)致蠶蛹源ACE抑制肽在消化前后的活性發(fā)生了變化。

圖4 蠶蛹源ACE抑制肽的葡聚糖凝膠G-50色譜圖Fig.4 Sephadex G-50 chromatogram of ACE-inhibitory peptides from silkworm pupae

2.2 蠶蛹源ACE抑制肽對(duì)ACE抑制動(dòng)力學(xué)分析

利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法對(duì)蠶蛹源ACE抑制肽的抑制模式進(jìn)行研究。蠶蛹源ACE抑制肽的ACE抑制曲線見圖5。

圖5 蠶蛹源ACE抑制肽的ACE抑制曲線Fig.5 ACE inhibition curves of the ACE-inhibitory peptides from silkworm pupae

從圖5可以看出，當(dāng)蠶蛹源ACE抑制肽的質(zhì)量濃 度 分 別 為 0、0.01、0.05 mg/mL 時(shí) ， 它 們 的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線相交于y軸，這說明蠶蛹源ACE抑制肽對(duì)ACE的抑制模式是競(jìng)爭(zhēng)性抑制[15]。這與已報(bào)道的草魚源ACE抑制肽[2]、大豆源ACE抑制肽[10]和灰樹花源ACE抑制肽[16]等的抑制模式相同。根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線的回歸方程，得到蠶蛹源ACE抑制肽的抑制常數(shù) （Ki）為0.06 mg/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于降血壓藥物 Captopril的 Ki值（0.006 7 μg/mL）[17]，這表明蠶蛹源 ACE 抑制肽對(duì)ACE的抑制活性遠(yuǎn)低于Captopril。盡管蛹源ACE抑制肽的活性沒有Captopril的高，但卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于綠豆源 ACE抑制肽 （Ki=0.31 mg/mL）[11]、 紅扁豆源ACE抑制肽（Ki=0.46 mg/mL）[11]和油菜籽源 ACE抑制肽（Ki=0.2 mg/mL）[18]。

2.3 蠶蛹源ACE抑制肽對(duì)ACE的紫外光譜影響

在蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜中，色氨酸和酪氨酸在280 nm波長(zhǎng)附近有一個(gè)吸收峰；苯丙氨酸在257 nm波長(zhǎng)附近有一個(gè)吸收峰[19]。蠶蛹源ACE抑制肽對(duì)ACE的紫外光譜影響見圖6。從圖6可以看出，ACE與蠶蛹源ACE抑制肽相互作用30 min后，在240～280 nm附近的紫外吸光值發(fā)生明顯的變化。與對(duì)照組（0 min）相比，相互作用30 min后，ACE的紫外吸光值在240～280 nm附近均明顯升高。紫外光譜變化反映了蛋白質(zhì)在溶液中的構(gòu)象變化，紫外吸光度的增加說明蛋白質(zhì)分子發(fā)生了伸展[19-20]。此結(jié)果初步說明，蠶蛹源ACE抑制肽能夠改變ACE的分子結(jié)構(gòu)，而這種結(jié)構(gòu)變化是導(dǎo)致ACE的酶活降低甚至完全喪失的直接原因。

圖6 蠶蛹源ACE抑制肽對(duì)ACE的紫外光譜影響Fig.6 Effects of ACE-inhibitory peptides from silkworm pupae on ultraviolet spectrum of ACE

3 結(jié)語

蠶蛹源ACE抑制肽耐高溫性能較差，在酸和堿環(huán)境中不穩(wěn)定。冷凍干燥和噴霧干燥對(duì)蠶蛹源ACE抑制肽的活性影響較?。慌c其它干燥方式相比，噴霧干燥的效率最高，適宜工業(yè)化生產(chǎn)。此外，蠶蛹源ACE抑制肽具有較強(qiáng)的耐受胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶消化的能力，經(jīng)該3種消化酶處理后，蠶蛹源ACE抑制肽仍能保留初始活性的94.0%；蠶蛹源ACE抑制肽對(duì)ACE的抑制模式為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，其抑制常數(shù)（Ki）為0.06 mg/mL，是一種活性較強(qiáng)的ACE抑制劑。蠶蛹源ACE抑制肽對(duì)ACE的紫外光譜有明顯影響，使ACE在240～280 nm附近的紫外吸光值明顯增加，初步揭示了蠶蛹源ACE抑制肽能夠改變ACE的分子結(jié)構(gòu)。

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