低溫脂肪酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)

王春雨， 遲乃玉， 張慶芳， 竇少華

（大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連116622）

脂肪酶 （Lipase，EC3.1.1.3）， 甘油三酰酯水解酶）是一類重要的工業(yè)酶，可以在油水界面上催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油以及甘油一酯和甘油二酯，廣泛存在于動物、植物各種組織及微生物中，是最早研究的酶類之一[1]。根據(jù)Msrgsin等人的定義[2]，把最適酶活溫度在30℃左右，在0℃左右仍有一定催化活性的脂肪酶稱為低溫脂肪酶。而大多數(shù)低溫脂肪酶是由低溫微生物生產(chǎn)，它們長期生活于低溫環(huán)境中，如南極、北極以及海洋底部等極端環(huán)境中。目前所發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)低溫脂肪酶的低溫微生物大都屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），氣單胞菌屬（Aeromonas）等[3-4]。

低溫脂肪酶具有高效、可低溫下作用、作用周期短等優(yōu)勢，在應(yīng)用上具有中高溫脂肪酶無法取代的優(yōu)越性，因此在食品、輕紡、化妝品、洗滌劑、有機(jī)合成、環(huán)境治理以及醫(yī)藥等領(lǐng)域上有廣泛的應(yīng)用前景。微生物脂肪酶種類多，作用溫度及pH值范圍比動植物脂肪酶廣，底物專一性高，且便于工業(yè)生產(chǎn)以獲得較高純度的酶制劑，已成為工業(yè)生產(chǎn)脂肪酶的主要來源[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

產(chǎn)低溫脂肪酶菌株:由作者所在實驗室從大連大黑山土壤和渤海海水中分離篩選得到。結(jié)合菌落形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rDNA序列分析，參照齊祖同[6]和Accensi[7]等的方法，鑒定并命名為蘇云金芽胞桿菌CZW001（BacillusthuringiensisCZW001）。

1.2 方法

1.2.1 蘇云金芽胞桿菌CZW001發(fā)酵 將菌株CZW001活化后，接種于種子液中（胰蛋白胨1.0 g/dL，酵母提取物0.5 g/dL，NaCl 1.0 g/dL，瓊脂1.5 g/dL，pH 7.0），20 ℃、160 r/min培養(yǎng) 12 h，轉(zhuǎn)接于 100 mL發(fā)酵液中 （酵母膏 0.5 g/dL，（NH4）2SO40.5 g/dL，KH2PO40.2 g/dL，NaCl 0.3 g/dL，MgSO4·7H2O 0.05 g/dL，橄欖油體積分?jǐn)?shù) 2%，pH 7.0），20 ℃、160 r/min培養(yǎng)2 d。發(fā)酵液4℃、10 000 r/min離心10 min，獲取上清液。

1.2.2 硫酸銨沉淀 將100 mL發(fā)酵上清在冰浴中邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨粉末至65%飽和度，4℃靜置4 h。離心收集沉淀，將沉淀溶解于50 mL、0.05 mol/L pH 8.2的Tis-HCl緩沖液中，并用相同的緩沖液4℃透析12 h。

1.2.3 超濾濃縮 經(jīng)截留相對分子質(zhì)量為10 000的中空纖維柱超濾濃縮。

1.2.4 離子交換層析 先用Tis-Hcl緩沖液（0.05 mol/L pH 8.2）以0.5 mL/min的流速平衡DEAE-纖維素-52層析柱（1.6 cm×30 cm）5～10 個體積，直至UV280成水平直線上。將2 mL濃縮液加到層析柱上，用250 mL 0～1mol/L的NaCl以 0.3 mL/min的流速線性梯度洗脫。利用平板定性檢測脂肪酶活性，收集含脂肪酶各管，測定其酶活，合并含酶活各管。

1.2.5 凝膠過濾層析 Sephadex G-100（Φ1.6×50 cm）預(yù)先用 Tis-Hcl緩沖液（0.05 mol/L pH 8.2） 以0.3 mL/min的流速平衡。將含脂肪酶樣品2 mL超濾濃縮后上柱，用0.05 mol/L pH 8.2 Tis-Hcl緩沖液洗脫，收集有酶活性部分。

1.2.6 蛋白質(zhì)濃度的測定 采用Bradford法[8]進(jìn)行測定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。

1.2.7 脂肪酶活性的測定 采用分光光度計法測定脂肪酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶的分離純化

蘇云金芽胞桿菌CZW001脂肪酶發(fā)酵上清液經(jīng)硫酸銨沉淀、超濾離心、DEAE-纖維素-52離子交換層析和Sephadex G-100凝膠過濾層析等純化步驟，脂肪酶純化倍數(shù)為75.5倍，活性回收率為37.6%。其中DEAE-纖維素-52離子交換層析效果最佳，僅此一步就純化了56倍，純化效果見表1。SDS-PAGE凝膠電泳[9]顯示純化后的脂肪酶為單一條帶，見圖1，相對分子質(zhì)量約為40 000。

圖1 12 g/dL SDS-PAGE電泳圖譜Fig.1 12 g/dL SDS-PAGE of enzyme solution

2.2 低溫脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 pH對脂肪酶活力的影響 在30℃、pH 4.0～10.0的緩沖溶液中分別測定脂肪酶，測定3次求平均酶活力，結(jié)果見圖2。該脂肪酶的適宜作用pH范圍在 7～9，最適 pH 為8。

表1 脂肪酶的純化Table 1 Purification of Bacillus thuringiensis CZWOO1 lipase

圖2 pH值對酶活力的影響Fig.2 Effects of pH on lipase activity

2.2.2 溫度對脂肪酶活力的影響 在pH 8.0條件下，測定0～45℃酶活力與溫度的關(guān)系，結(jié)果見圖3。CZW001脂肪酶活力在25℃達(dá)到最高，在0℃是仍具有酶活，相對酶活達(dá)10%。

圖3 溫度對酶活力的影響Fig.3 Effects of temperature on lipase activity

2.2.3 溫度對酶穩(wěn)定性的影響 將酶液在不同溫度下作用不同時間，測定低溫脂肪酶殘余活力。結(jié)果見圖4。菌株CZW001脂肪酶穩(wěn)定性較差，在60℃處理30 min，酶活損失達(dá)70%。

2.2.4 金屬離子對酶活性的影響 酶催化效果受諸多因素的影響，如不同的金屬離子對酶活力的影響不同。它們有可能是酶的組成部分，也有可能是酶的激活劑或抑制劑。因而向酶解環(huán)境中或酶制劑儲存過程中添加不同的金屬離子對酶的催化效率及其穩(wěn)定性影響較大，在酶反應(yīng)液中加入Pb+、Na+、Ca2+、Mg2+、Al3+、Li+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+及 EDTA，使其終濃度為1 mmol/L，同時以不加金屬離子的酶液作為對照，測定脂肪酶的活性，結(jié)果見圖5。Ca2+、Mg2+和Cu2+能提高脂肪酶的活力，尤其是Ca2+作用最為明顯，達(dá)到 230%。 Al3+、Zn2+、Fe2+對蘇云金芽孢桿菌CZW001脂肪酶有顯著的抑制作用，尤其是Zn2+和Fe2+，僅保留32%和24%的殘余酶活力，這與Sugihara 報道的實驗結(jié)果一致[10]。 Pb+、Na+、Li+、Mn2+和EDTA對蘇云金芽胞桿菌CZW001脂肪酶活力影響不明顯。

圖4 溫度對酶穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of temperature on lipase stability

圖5 金屬離子及EDTA對酶活性的影響Fig.5 Effect of metal ion and EDTA on enzyme

2.2.5 不同有機(jī)溶劑對脂肪酶活力的影響 如圖6所示，脂肪酶對醇類有機(jī)溶劑的耐受性隨碳鏈增加而減小，因此在進(jìn)行醋化反應(yīng)或轉(zhuǎn)醋反應(yīng)時宜選用短鏈醇或短鏈酯（如乙酸甲酯）作為反應(yīng)底物。

圖6 脂肪酶在不同有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性Fig.6 Effect of various organic solvents on lipase stabilily

2.2.6 脂肪酶對不同油脂的水解特異性 分別以橄欖油、豆油、桐油、菜籽油、茶油、棉籽油、蓖麻油和三油酸甘油醋作為水解底物，測定脂肪酶活力，結(jié)果見圖7。

該脂肪酶對豆油表現(xiàn)明顯的特異性，對橄欖油、桐油、菜籽油、茶油、棉籽油、蓖麻油、三醋酸甘油酯未表現(xiàn)出特異性，而水解蓖麻油能力最低，是蓖麻油酸值過高（大于33.45）抑制了脂肪酶的水解活力，而不是因為油脂中脂肪酸碳鏈長度的差異造成的（上述油脂中主要脂肪酸碳鏈均為C18）。

3 結(jié)語

Bacillus thuringiensis CZW001脂肪酶發(fā)酵上清液經(jīng)硫酸銨沉淀、透析、超濾離心、DEAE-纖維素-52離子交換層析和Sephadex G-100凝膠過濾層析得到電泳純的脂肪酶，跑SDS-PAGE凝膠電泳，相對分子質(zhì)量大約為40 000，與已報道低溫脂肪酶相對分子質(zhì)量大小有區(qū)別，如Pseudomonas frasi脂肪酶相對分子質(zhì)量為 32 500[11]，Pseudomonas sp．Strain KB700脂肪酶相對分子質(zhì)量為49 900[12]。

Bacillus thuringiensis CZW001脂肪酶的最適作用溫度為25℃，對熱敏感，60℃處理30 min僅殘留30%酶活性，酶的適宜作用pH范圍在7～9，最適pH為8，大多低溫脂肪酶對熱敏感，如Pseudomonas sp.Strain KB700脂肪酶[12]在60℃處理5 min，殘余酶活就急劇降低70%，LipP[13]在60℃處理30 min，殘余酶活為25%。

Bacillus thuringiensis CZW001脂肪酶的水解活性對 Ca2+表現(xiàn)明顯的依賴性，而 Al3+、Zn2+和 Fe2+對脂肪酶有顯著的抑制作用。到目前為止，細(xì)菌脂肪酶Ca2+的結(jié)合位點(diǎn)和Ca2+對脂肪酶的激活機(jī)理己基本清楚，但脂肪酶活性對Ca2+的依賴性表現(xiàn)出來的差異是否說明了脂肪酶在結(jié)構(gòu)上存在差異[14]，有待進(jìn)一步證實。

總之，該低溫脂肪酶具有高效、耐堿和對熱敏感等特點(diǎn)，在食品、洗滌、紡織以及環(huán)境治理等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。尤其在食品行業(yè)中，由于對熱敏感，從而避免高溫滅活對食品品質(zhì)產(chǎn)生的破壞。

[1]QU YEN D T，SCHMIDT-DANNERT C，SCHMID R D.High-level expression of a lipase from Bacillus thermocatenulatus BT L2 in Pichia pastoris and some properties of the recombinant lipase[J].Protein Expression and Purification，2003，28 （1）:102-110.

[2]林學(xué)政，邊際.極地微生物低溫適應(yīng)性的分子機(jī)制[J].機(jī)制極地研究，2003，15（1）:75-82.LIN Xue-zheng，BIAN ji.Molecular mechanism of cold-adaptation of polar microorganisms[J].Chinese Journal of Polar Research，2003，15（1）:75-82.（in Chinese）

[3]Rashid N，Shimada Y.Low-temperature lipase from psychrotrophic Pseudomonas sp.strain KB700A [J].Applied and Environmental Microbiology，2001，67（9）:4064-4069.

[4]Han-Ki Lee，Min-Jung Ahn.Purification and characterization of cold active lipase from Psychrotrophic aeromonas sp.LPB 4[J].The Journal of Microbiology，2003，41（1）:22-27.

[5]王蕾，蔡宇杰.一株堿性低溫脂肪酶產(chǎn)生菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2008，27（3）:1673-1689.WANG Lei，CAI Yu-jie.Optimization of eermentation conditions for a low-temperature lipase-producing strain[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2008，27（3）:1673-1689.（in Chinese）

[6]Qi Z T.Flora Fungorum Sinicorum:Aspergilluset teleomorphi Cognati[M].Beijing:Science Press，1997.

[7]Accensi F，Cano J，F(xiàn)ignera L，et al.New PCR method to differentiate species in the Aspergillus niger aggregate[J].FEMS Microbiology Letters，1999，180（2）:191-196.

[8]Braford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of micrograrn quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding[J].Analytical Biochemistry，1976，72:248-254.

[9]Laemmli U K.Cleavage of structura1 proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J].Nature，1970，227（5259）:680-685.

[10]Sugihara A，Shimada Y，Tominaga Y.Purification and characterization of Aspergillus niger lipase[J].Agricultural and Biological Chemistry，1988，52（6）:1591-1592.

[11]Alquati C L，De Gioia，G Santarossa，et al.The cold-active lipase of Pseudomonas fragi.heterologous expression，biochemical characterization and molecular[J].Eur J Biochemical，2002，269:3321-3328.

[12]Rashid N Y，Shimada S，Ezaki H Atomi，et al.Low-temperature lipase from psychrotrophic Pseudomonas sp.strain KB700A[J].Appl Environ Microbiol，2001，67:4064-4069.

[13]Choo，D W T Kurihara，T Suzuki，et al.A cold-adapted lipase of an alaskan psychrotroph，Pseudomonas sp.strain B11-1:gene cloning and enzyme purification and characterization[J].Appl Environ Micobiol，1998，64:486-491.

[14]Amada K，Kwon H J，Haruki M，et al.Ca2+-induced folding of a family I.3 lipase with repetitive Ca2+binding motifs at the C-terminus[J].FEBS Letters，2001，509（1）:17-21.